[发明专利]在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗生产菌株领域，具体涉及一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及携带该载体的白喉杆菌。 

背景技术

白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌,属于棒状杆菌属(Corynebacterium)，其生长周期短，繁殖速度快。 

白喉杆菌的致病物质主要是白喉毒素，白喉毒素以分泌型表达方式存在于胞质外，且白喉杆菌其胞质外的分泌蛋白除白喉毒素外，其他杂蛋白含量极小，其对于白喉毒素的纯化十分有利，因此白喉杆菌广泛的应用于疫苗发酵生产中作为白喉毒素和白喉毒素突变体(CRM197)的生产工程菌株。 

而目前多采用的用于抗原发酵生产的表达体系有大肠杆菌，植物细胞等，其缺点是杂蛋白含量较高，多为胞内或包涵体内表达，对于后期的纯化工艺有很高的时间和人力，物力成本；而分泌型的表达系统的建立多需要引导肽的引入，但往往其要求与抗原蛋白融合表达，则需要在后期工艺中对引导肽进行切除处理，增加了工艺的复杂度和操作的难度。至今未有报道利用白喉杆菌携带可复制质粒用于抗原表达的研究和应用。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体。 

本发明的第二个目的是提供一种携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。 

本发明的第三个目的是提供一种重组CRM197蛋白的表达方法。 

本发明的技术方案概述如下： 

一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，所述载体包括：由SEQ ID NO.1所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO.1所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO.2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ IDNO.3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。 

一种携带上述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。 

一种重组CRM197蛋白的表达方法，包括如下步骤： 

a.将在白喉杆菌中稳定复制的表达载体通过结合转移的方法导入宿主白喉杆菌中； 

b.筛选得到携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌； 

c.将步骤b获得的白喉杆菌进行蛋白表达和分泌，得到重组CRM197蛋白；所述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体包括：由SEQ ID NO.1所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO.1所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序 列，能表达SEQ ID NO.2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO.3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。 

所述宿主白喉杆菌优选编号为ATCC39255的白喉杆菌，ATCC43145的白喉杆菌或CMCC38007白喉杆菌。 

本发明的优点是：白喉杆菌携带的在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，因其具有在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，因而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时表达载体上的能表达导肽蛋白序列的DNA序列可以使得表达的CRM197重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞外，从而使得CRM197重组蛋白的表达量得到提高，使得表达的CRM197重组蛋白的纯化工艺进一步简化，提高了蛋白得率，节约了生产时间和成本。 

附图说明

图1为一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5.1酶切鉴定图谱。 

图2为携带pCKM5.1的白喉杆菌（ATCC39255的白喉杆菌）高效分泌表达蛋白CRM197SDS-PAGE图谱。 

图3为携带pCKM5.1的白喉杆菌（ATCC39255的白喉杆菌）发酵制备CRM197蛋白的SDS-PAGE图谱。（1 A1 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8 A8 9Marker） 

图4为携带pCKM5.2的白喉杆菌（ATCC39255的白喉杆菌）高效分泌表达蛋白CRM197SDS-PAGE图谱。