[发明专利]血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法

说明书

技术领域

    本发明属于生化检测技术领域，特别是涉及血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法。 

背景技术

近年来，随着群体蛋白质组学概念的提出和其在实际研究中的应用，实验研究和临床应用之间的距离将进一步缩短。由于人体体液中因疾病引起的蛋白质的含量及种类变化是临床上各种病症早期诊断及评价病情的重要指标，因此应用现代生物技术，寻找与疾病相关的特异性蛋白变化是当前研究的热点。然而，迄今为止能用于常规临床检测的生物标志物还非常的少。理论上，因为蛋白质的分子量较大，较难进入体液循环中，而一些蛋白质降解后的片段，却有可能通过某种途径进入到体液或血液中。以血清为例，近年来，血清蛋白质组中的低分子量范围颇受关注。而质谱技术的迅速发展和广泛使用，又为血清蛋白质组中的低分子量范围的研究提供了有效的手段。 

现有的针对低分子量蛋白检测的方法一般是使用电泳等分离技术对蛋白分子量进行筛分后用富集材料将目标分析物进行富集，再辅以后续的洗脱步骤，从而进行质谱检测。这种方法步骤繁琐，且多步的分离和洗脱操作可能将微量的低分子蛋白丢失。 

目前，低分子量蛋白质的分析的难点主要在于：1) 在分离过程中容易丢失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2) 在质谱鉴定过程中容易被其他高分子量蛋白质的信息掩盖；3) 更容易受到盐、表面活性剂等小分子的干扰影响质谱鉴定等。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单，灵敏度高，重现性好的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法。 

为此，本发明采用的技术方案是这样的：血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，包括以下步骤： 

a、根据目标蛋白分子量的大小和溶液组成，用电化学刻蚀法刻蚀一定孔径的多孔硅，将刻蚀后的多孔层从硅基底上剥离下来，进行超声破碎；超声破碎后的悬浊液经过离心干燥后，得到未经修饰的多孔硅颗粒；

b、用化学修饰法对步骤a中得到的多孔硅颗粒进行修饰，制备成可以选择性捕获蛋白质的筛分材料，使其对不同等电点的蛋白质具有特异性的捕获能力；

c、将步骤b中得到的筛分材料3 mg加入到50 uL待检血清中，低温进行振荡吸附0.5~1 h，充分作用后静置，利用多孔硅颗粒的自然沉降作用将富集了低分子量蛋白的多孔硅颗粒从溶液中分离出来；

d、从溶液中分离出的多孔硅颗粒分别用0.2 mmol·L^-1的PB缓冲液和去离子水清洗，去除表面吸附的高丰度蛋白和盐类后，直接滴到MALDI靶上，室温干燥；然后将1 uL有机基质溶液（2-氰基-4-羟基肉桂酸，α-CHCA）点覆在多孔硅颗粒上，室温自然干燥后将制备好的样品送入MALDI-TOF质谱仪检测；

e、根据质谱结果经数据统计处理后进行分层聚类分析，通过分析结果判断患者的病情。

进一步地，步骤b中的化学修饰法具体为：将多孔硅颗粒进行臭氧氧化处理5~20分钟，形成表面硅氧键；将氧化后的多孔硅颗粒浸泡在体积浓度为1%的硅烷化试剂与有机溶剂的混合溶液中反应1小时，再在烘箱中110℃干燥15分钟，蒸干后的多孔硅颗粒用乙醇浸泡洗净；根据目标蛋白的分子量选出相应孔径的多孔硅，再根据目标蛋白的性质选择相应的硅烷化试剂进行表面修饰；硅烷化试剂的种类可以采用氨基硅烷化试剂，巯基硅烷化试剂，环氧基硅烷化试剂中的一种。 

 更进一步地，本发明的方法还可以有以下步骤： 

f、余下的多孔硅颗粒可直接加入电泳缓冲液，进行凝胶电泳分析。

g、使用后的多孔硅颗粒可用蛋白洗脱液洗涤后重复使用。 

与现有技术相比，本发明的方法具有如下有益效果： 

1、本发明通过制备多孔硅颗粒达到一步分离、富集和检测血清样品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔径大小可以通过电化学刻蚀条件精确控制，根据所要筛选的蛋白质分子量大小，对相应材料的孔隙率进行选择。通过表面修饰技术可以选择性的捕获低分子量生物标记物，同时将人血清中含量丰富的高分子量蛋白质和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低丰度蛋白的降解。多孔硅颗粒的制备条件选择是该分离材料性能优越的一项关键技术。

2、本发明中材料的孔径可以根据带分析目标物的大小进行随意调控，并利用多孔硅表面可进行多种化学修饰，可选择性地从待测生物样品中捕获某一种类的目标蛋白质。同时，可以通过在各检测点内修饰不同的基团，进行一种试样的多维分析检测。