[发明专利]一种检测低丰度低分子量蛋白谱的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于化学测定技术领域，特别是涉及一种用于直接检测复杂样品中低丰度低分子量蛋白谱的试剂盒。

背景技术

近年来，随着群体蛋白质组学概念的提出和其在实际研究中的应用，实验研究和临床应用之间的距离将进一步缩短。由于人体体液中因疾病引起的蛋白质的含量及种类变化是临床上各种病症早期诊断及评价病情的重要指标，因此应用现代生物技术，寻找与疾病相关的特异性蛋白变化是当前研究的热点。然而，迄今为止能用于常规临床检测的生物标志物还非常的少。理论上，因为蛋白质的分子量较大，较难进入体液循环中，而一些蛋白质降解后的片段，却有可能通过某种途径进入到体液或血液中。以血清为例，近年来，血清蛋白质组中的低分子量范围颇受关注。而质谱技术的迅速发展和广泛使用，又为血清蛋白质组中的低丰度低分子量范围的研究提供了有效的手段。

现有的针对低分子量蛋白检测的方法一般是使用电泳等分离技术对蛋白分子量进行筛分后用富集材料将目标分析物进行富集，再辅以后续的洗脱步骤，从而进行质谱检测。这种方法步骤繁琐，多步的分离和洗脱操作可能将微量的低分子蛋白丢失，并且需要相当庞大的检测设备。

目前，低丰度低分子量蛋白质的分析的难点主要在于：1) 在分离过程中容易丢失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2) 在质谱鉴定过程中容易被其他高分子量蛋白质的信息掩盖；3) 更容易受到盐、表面活性剂等小分子的干扰影响质谱鉴定等。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种便携的试剂盒，用于检测低丰度低分子量蛋白谱。

为此，本发明采用的技术方案是这样的：一种检测低丰度低分子量蛋白谱的试剂盒，包括盒体，盒体内设有分离装置、蛋白分离富集材料、稀释缓冲液、清洗缓冲液，蛋白分离富集材料放置在分离装置中，其特征在于：所述的蛋白分离富集材料为多孔硅颗粒，孔道直径在1-50nm之间，其孔道表面具有化学修饰基团，所述的化学修饰基团为阴离子交换基团或阳离子交换基团或疏水基团或极性基团。

所述的化学修饰基团选自氨基、巯基或环氧基中的一种。

进一步地，所述的蛋白分离富集材料是通过如下步骤得到的:

A）将P型掺硼硅片固定在电解池中，按体积比为1：4～6的比例加入乙醇和重量浓度为40%的氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，进行直流电解刻蚀和脱膜，设定电流强度为0~100mA，刻蚀时间为0~15分钟，刻蚀脱膜后的多孔硅层用乙醇冲洗干净后超声粉碎5~20分钟，再用氮气吹干，所得的多孔硅颗粒的孔径在5~20nm；

B）将上述多孔硅颗粒进行臭氧氧化处理5~20分钟，形成表面硅氧键；

C）将氧化后的多孔硅颗粒浸泡在体积浓度为1%的硅烷化试剂与有机溶剂的混合溶液中反应1小时，再在烘箱中110℃干燥15分钟，蒸干后的多孔硅颗粒用乙醇浸泡洗净；

D）选择所需孔径的多孔硅，用氨基硅烷化试剂、巯基硅烷化试剂或环氧基硅烷化试剂进行表面修饰。

更进一步地，所述的分离装置为离心管或微柱或芯片-微流控装置。

本发明在使用时，通过分离装置及蛋白分离富集材料来得到所需的低丰度低分子量蛋白，然后进行MALDI-TOF检测，获得高质量的肽谱。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过制备多孔硅颗粒达到一步分离、富集和检测血清样品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔径大小可以通过电化学刻蚀条件精确控制，根据所要筛选的蛋白质分子量大小，对相应材料的孔隙率进行选择。通过表面修饰技术可以选择性的捕获低分子量生物标记物，同时将人血清中含量丰富的高分子量蛋白质和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低丰度蛋白的降解。多孔硅颗粒的制备条件选择是该分离材料性能优越的一项关键技术。

2、本发明中材料的孔径可以根据带分析目标物的大小进行随意调控，并利用多孔硅表面可进行多种化学修饰，可选择性地从待测生物样品中捕获某一种类的目标蛋白质。同时，可以通过在各检测点内修饰不同的基团，进行一种试样的多维分析检测。

3、本发明中富集后的颗粒进行表面清洗后无需进行额外的洗脱除盐步骤，即可进行MALDI-TOF检测，获得高质量的肽谱。检测后多余的多孔硅颗粒可直接进行凝胶电泳分析，对感兴趣的差异蛋白进行进一步的分离鉴定。避免了样品多步处理和洗脱过程所造成的损失。

4、本发明中设备简单便携，检测方法准确快捷。整个测定过程一般可以在几分钟内就全部完成，十分迅速，简单易行，且捕获特异性高，同时不会破坏所测定的蛋白质。

附图说明

图1是本发明中微柱分离装置示意图。