[发明专利]沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。 

背景技术：

沙门氏菌（Salmonella，Sa.）是重要的食源性致病菌之一，在世界各国细菌性食物中毒病例中，Sa引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。随着分子生物学的发展，已有针对沙门氏菌invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY等基因为目标基因，用普通PCR或荧光PCR检测沙门氏菌的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。 

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确，目前应用于基因表达病毒检测、SNP分析、耐药基因检测、真菌鉴定、DNA甲基化分析等多个领域。焦磷酸测序是一种基于合成的新型DNA测序技术，在特异引物的引导下，根据待测序列分别加入四种核苷酸，在延伸的过程中释放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光，通过检测器检测相应的荧光强度，从而获得检测样本中的核苷酸序列，是一种非常实用的短序列实时检测技术，定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测，具有DNA测序法无法比拟的优势，已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监测。李秀娟等以fimy为目的基因 用PCR-焦磷酸测序法从属的水平上检测159株不同来源的沙门氏菌，但该方法不能区分不同血清型沙门氏菌，文章中也未说明检测的159株沙门氏菌血清型，其特异性有待进一步验证（李秀娟，田会方）。 

发明内容：

本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。 

本发明根据沙门氏菌aceA基因（GenBank:U43344.1）、肠炎沙门氏菌（SE）特异序列（GenBank:AF370707.1）、鼠伤寒沙门氏菌（ST）的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1），分别设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA序列水平上检测沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，从而实现了本发明的目的。 

本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物，其特征在于包括PCR引物和测序引物： 

针对沙门氏菌的PCR引物： 

5’-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’；（如SEQ ID NO.1所示） 

5’-GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’；（如SEQ ID NO.2所示） 

测序引物：5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’；（如SEQ ID NO.3所示） 

针对肠炎沙门氏菌的PCR引物： 

5’-GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’；（如SEQ ID NO.4所示） 

5’-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’；（如SEQ ID NO.5所示） 

测序引物：5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’；（如SEQ ID NO.6所示） 

针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物： 

5’-AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’；（如SEQ ID NO.7所示） 

5’-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’；（如SEQ ID NO.8所示） 

测序引物：5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’；（如SEQ ID NO.9所示）。 

本发明的第二个目的是提供沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为： 

针对沙门氏菌的PCR引物：