[发明专利]玉米MuDR转座子插入侧翼序列的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及玉米DNA领域，尤其涉及一种玉米MuDR转座子插入侧翼序列的分离方法。  

背景技术

[0002] 随着玉米基因组测序的完成，为玉米基因组研究和实际应用带来了新的机遇和挑战。玉米B73基因组约85%由转座子组成的，其中含量较多、结构最复杂的是Mutator（Mu）转座子家族。由于转座子结构和遗传的特点，转座子标签技术研究已成为功能基因组研究的重要领域，同时也为创制育种材料提供快速简捷的途径。 

转座子标签技术以转座子插入的侧翼序列的有效分离、及侧翼序列与突变性状共分离为目标的，其中MuTAIL-PCR技术是实现该目标的重要技术之一。该技术以Mu转座子保守序列设计引物（Settles, 2004），并经Tail-PCR方法改进，分离Mu转座子插入侧翼序列的方法（Liu,1995）。利用MutailPCR方法有效分离和克隆了籽粒颜色Myb基因和p1基因（Robbins，2008；Zhang,2005）等，同时该方法对基因组DNA质量要求不高，实验流程简单，耗时少，被多数利用Mu转座子分离和克隆基因的研究者们所采用。 

MuTAIL-PCR技术是Settles等（2004）根据Mu转座子家族反向重复序列（Terminal Inverted Repeat ，TIR）的保守序列设计的特异性引物进行侧翼序列的扩增。Mu转座子家族据Mu内部序列的保守性将其分为6个亚族，Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7、Mu8和Mu9/Mu5，而将Mu9，及与Mu转座活性相关的转座子Cy等命名为MuDR（Bennetzen et al., 1993）。Mu转座子家族中仅MuDR包含转录基因MuDRA和MuDRB，且转录起始位点在Mu-TIR内，能实现MuDR的自主性转座（Hershberger et al., 1995），因而采用MuDR原始群体与其他玉米自交系杂交后代构建的突变体远远高于其家族中其他类型转座子构建的突变体效率，故仅以MuDR的保守序列设计引物分离和克隆Mu转座子插入的目标基因将更具有实际意义。 

但现有技术中，存在一些技术问题有待解决，如下： 

1、根据Mu转座子家族反向重复序列的保守序列设计的特异性引物扩增目标插入基因，致使全部Mu转座子家族及其目标基因进行扩增，而对诱变材料后代产生突变体的MuDR无法进行特异性扩增，因而干扰了突变性状与目标基因的联系的建立；

2、MuDR诱变材料后代是产生Mu转座子插入突变体的主要来源，原有的技术方法是针对Mu家族扩增，而非特异性扩增MuDR及其目标基因，会造成巨大的时间、试剂的无效浪费，突变体目标基因有效扩增效率的下降。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种玉米MuDR转座子插入侧翼序列的分离方法，其可实现转座子插入的侧翼序列的有效分离，提供创制育种的便捷途径。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种玉米MuDR转座子插入侧翼序列的分离方法，包括如下步骤： 

第一、MuDR诱变材料的制取：用杂交方式构建诱变群体，并筛选出突变体材料；

第二、突变体材料的DNA提取；

第三、巢式引物和简并引物设计：在MuDR转座子TIR序列的保守序列设计巢式引物TIR9-1和TIR9-2序列，所述TIR9-1序列为：ATAGAAGCCAACGCCATGGCCTCCATTTCGTC，所述TIR9-2序列为：GGCCTCCATTTCGTCGAATCCCTT；简并引物是根据物种共享的蛋白质的保守氨基酸序列设计；

第四、进行MuTAIL-PCR反应，并在反应中添加甘油和二甲基亚砜；

第五、MuDR转座子插入侧翼序列的真实性检测。