[发明专利]异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物合成菌代谢工程分子改造技术领域，特别涉及异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法。

背景技术

目前，能源危机与环境问题已经迫在眉睫，迫切需要改变当今社会发展对于化石燃料过度依赖的现状。随着生物技术的不断进步与发展，生物乙醇、生物柴油与生物丁醇等的研究日益广泛。绿色燃料的开发与利用对于缓解能源危机、解决环境问题，实现可持续发展具有长远意义。

异丁醇是一种四碳平台化合物，广泛应用于化工、医药与能源等众多工业生产领域。此外，异丁醇是一种高级支链醇，具有能量密度高、吸水性低、辛烷值高，以及能利用现有的管道设备运输等优点，与传统的生物燃料相比较，是一种更具有应用前景的石油替代品。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性模式菌株。与其他菌种相比，该菌株对异丁醇具有更高的耐受性。此外，该菌株遗传背景清楚、基因工程可操作性强、无密码子偏好性，并且是被美国食品药品管理局（FDA）认可的安全微生物。因此，利用枯草芽孢杆菌被认为是一种理想的异丁醇生物合成宿主。然而，枯草芽孢杆菌自身不存在异丁醇合成途径，不能合成异丁醇。

合成生物学作为一个新兴的前沿学科，由于其巨大的潜在应用价值而成为各国政府争相抢占的资助领域和各科研机构的研究热点。近年来，合成生物学在生物能源、生物医药和生命合成等领域取得了长足发展和重要突破。2008年，Liao领导的研究组从酿酒酵母、乳酸乳球菌及丙酮丁醇梭菌中引入2-酮酸脱氢酶，从酿酒酵母中引入2-乙醇脱氢酶，通过基因优化和重构，实现大肠杆菌内全新的高级醇合成路径，研究结果发表在《Nature》杂志上（Atsumi S,Hanai Liao JC.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.Nature,2008,451:86-89.）。2009年，通过对细长聚球蓝细菌的基因工程改造，增加1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的表达量，并将来自乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌的相关基因进一步导入工程菌，使之利用CO₂和光生产异丁醛，成功实现利用光来生产生物能源分子（Atsumi S,Higashide Liao JC.Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde.Nat Biotechnol,2009,27:1177-1180.）。2010年，Liao研究组利用乙酰羧酸合成酶链延长模块和酮酸脱羧酶，在蓝细菌PCC7942中构建了由丙酮酸到异丁醛的合成途径（Li H,Cann AE Liao JC.Biofuels:biomolecular engineering fundamentals and advances.Annu Rev Chem Biornol Eng,2010,l:19-36.）。合成的异丁醛是平台代谢物，可以生成一系列具有重要功能的生物分子。2010年，美国LS9生物技术公司利用在蓝细菌中发现的脂酰ACP还原酶和醛脱羰酶以原核生物脂肪酸合成途径的中问代谢物脂酰ACP为底物，合成烷烃类和烯烃类，论文发表在2010年《Science》杂志上（Schirmer A,Rude MA,Li X,et a1.Microbial biosynthesis of alkanes.Science,2010,329(5991):559-562.）。基于此，我们利用合成生物技术对枯草芽孢杆菌引进一条异源途径——Ehrlich途径，并通过扩增乙酰乳酸合酶强化了2-酮异戊酸前体合成途径（Li SS.,Wen JP*.,Jia XQ.Engineering Bacillus subtilis for isobutanol production by heterologous Ehrlich pathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression.Appl Microbiol Biotechnol.,2011,91:577-589.），使野生枯草芽孢杆菌成为异丁醇合成菌，产量达到了2.62g/L。