[发明专利]一种碱基选择性可控延伸的STR序列高通量检测方法及其检测试剂

说明书

技术领域

本发明一种碱基选择性可控延伸的STR序列高通量检测方法及其检测试剂属于生物技术中高通量DNA测序领域，特别涉及运用第二代高通量测序技术来进行STR序列的检测方法。

背景技术

第二代高通量DNA测序：人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响。人们能够从基因水平上认识生命现象的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用。就基因序列分析而言，后基因组时代的重点已由单个物种的全基因组序列测定转移到了对某一物种在基因组DNA序列层次上个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。目前，在寻找新的功能基因和疾病相关的突变位点方面，人们仍然主要使用常规的Sanger DNA测序法。这一方法存在通量低和成本高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，但是尽管目前这一费用已经降低到大约2千万美元以下，功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年提出了1000美元人类全基因组测序的研究目标。2004年初，美国国立卫生院投入巨资支持DNA测序新技术的研究。他们的目标是在近年内发展10万美元的人类全基因组DNA测序技术，并最终减低为1千美元。

自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台以来，曾推出过3730xl DNA测序仪的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454测序仪，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台。为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD测序仪。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。

这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。

DNA指纹识别以及STR检测技术：1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。它具有如下的特点：

1.高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10^-11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10^-19。全世界人口约50亿，即5×10⁹。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2.稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3.体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。

1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。