[发明专利]电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法。

背景技术

高通量测序技术是最近发展起来的DNA测序技术。相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取几十万至几千万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到500bp。不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到30G不等的碱基数据，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。而实现高通量测序的核心是如何在一个系统内高效的捕获单分子模板，使之形成一个个独立分隔的微型反应器。

目前的捕获技术主要有两种：液相-微珠或磁珠-乳液PCR（In-solution capture emulsion PCR）技术和生物芯片杂交(Chip-hybridization capture)技术，其具体方法包括：

（1）基于芯片的杂交捕获方法，该方法中基因组DNA首先被打断，然后与定制的序列捕获芯片杂交，没有杂交上的被洗掉。富集的目标群体随后被洗脱并扩增，然后用高通量测序仪测序。这种方法的几大优势：1、定向捕获基因组目标区(目前一块芯片最长可捕获5MB的指定基因组区域；2、数据可靠；3、只要你选择出想要捕获的区域就会设计并合成一块定制的序列捕获芯片，使用方便省力。但是此方法随机性很强，不能保证被捕获的不同DNA片段比例与原始溶液中一致，基因组DNA的需要量比较多，对于稀有的珍贵基因组不适用，其特异性不及in-solution方法。

（2）基于in-solution的杂交捕获方法的基本流程为基因组DNA打断，然后精选大小合适的文库与RNA诱饵共孵育24小时形成RNA-DNA杂合体，再洗脱磁珠后进行PCR扩增，最后进行测序。这种方法的几大优势：1）极佳的特异性：高达90%的读出序列来源于RNA诱饵捕获，其中和靶向序列完全重合的超过50%；2）优秀的均一性：对基因组大片段序列，至少和捕获序列重合一半以上的RNA“诱饵”超过80%，即使对小片段的外显子序列，这一数字也超过60%；3）卓越的重现性：2组技术重复试验间的差异率不到10-5；4)可以精确地检测SNP。综上所述，实验结果完美验证了基于液相序列捕获的高通量平行靶向测序技术的特异性、准确性、重现性和广泛的应用前景。但是因为所用的诱饵是RNA，所以需要很高的操作要求，试剂或者器具都需要用无RNA酶的。而且操作步骤比较繁杂。

目前在新一代测序技术中，如第二代Roche的焦磷酸测序系统及ABI的SOLiD测序系统和第三代的Ion Torrent，所使用的是in-Solution杂交捕获单分子，然后进行浮液PCR(emulsion PCR)进行克隆扩增。Illumina的Solexa测序系统所使用的是芯片杂交捕获。

Roche的焦磷酸测序系统和Life Technologies的Ion Torrent测序系统包括：1）先将基因组进行超声破碎打断成短的约50-500bp片段，然后将片段的两端连接通用接头P1和P2。2）选择合适大小的微球共价结合上百万个引物P1在其表面，in-solution用微球捕获一个模板DNA到一个小球，利用emulsion PCR扩增单一模板，将同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。3）对携带有模板的微球进行富集。4）将携带有模板的微球加入到仪器的微孔阵列。这样微孔的利用率为50%左右，因为携带有模板的微球有两种一种是携带单一模板的微球；一种是非单一模板的微球，只有单一模板的微球符合测序要求。

ABI的SOLiD测序系统包括：1）首先进行基因组DNA的物理破碎，形成短的约50-200bp的DNA片段。2）将短的DNA片段两端连接通用接头A和B。3)In-solution用接有接头互补DNA的微球捕获，尽量做到一个微球捕获到一个单一模板DNA片段。4）将连有通用接头的模板在乳液体系里进行扩增（emulsion PCR），使同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。5）微珠上的DNA分子模板的3’端进行修饰后，把微球通过3’端共价联结到玻片表面进行测序反应。