[发明专利]一种抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽病免疫技术领域，具体地说是一种抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体的制备方法。 

背景技术

自2010年以来在华东地区首次发生鸭黄病毒感染蛋鸭引发的鸭产蛋下降-死亡综合症的流行，并迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要养殖场，之后传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。鸭子感染该病毒后，主要的临床表现为：病鸭出现高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停产；肉鸭出现生长迟缓。该病的发病率高达100%，死亡率在5%~10%之间。该病毒属于黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒。 

该病在我国属于首次报道，目前尚无商品化的抗体及疫苗上市，而该病近年来在我国水禽养殖区域的广泛流行以及其造成的巨大经济损失，更应加快研究抗鸭黄病毒卵黄抗体的研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体的制备方法，以预防及治疗鸭黄病毒病。 

本发明所说的鸭黄病毒，该病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏名称为鸭黄病毒AH-F10株，保藏日期：2012年4月18日保藏编号为：CCTCCNO:V201213。 

本发明解决技术问题采用如下方案： 

一种抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其制备包含如下步骤如下：（1）将该病毒疫苗免疫产蛋鸡；（2）分离免疫后鸡蛋卵黄；（3）提取卵黄抗体； 

所述该病毒疫苗按如下方法获得：取感染该病毒的鸡胚尿囊液，按体积比加入3‰甲醛于37℃摇床灭活36小时，灭活完成后，按体积比灭活病毒液96份，吐温-80（即聚山梨酯-80）4份摇匀，即得制苗用抗原，由它做为下步乳化的水相；白油佐剂做为下步乳化油相；按体积比油相3份、水相1份的比例取油相、水相搅拌乳化，制备成鸭黄病毒灭活油乳剂疫苗，并加入体积浓度1%硫柳汞溶液使之中终浓度为万分之一，摇匀备用； 

所述步骤（1）的具体方法为：将上述所得到的疫苗，以颈部皮下免疫处于产蛋高峰期的健康蛋鸡；疫苗用量为1mL/只，首次免疫一周后进行同等剂量及方式的加强免疫；第二 次免疫二周后进行第三次同等剂量及方式的免疫；此后每四周进行一次同等剂量及方式的加强免疫； 

所述步骤（2）的具体方法为：收集完成第三次免疫一周后所产的鸡蛋，用体积浓度75%的酒精对蛋壳进行消毒，待蛋壳表面干燥后，用蛋黄分离机分离蛋黄； 

所述步骤（3）的具体方法为：①使用含聚乙二醇的生理盐水与卵黄按质量比4:1搅拌均匀后离心15min，离心转速为5000转/分钟，离心完成后取其上清，将沉淀弃去；所述生理盐水氯化钠的质量分数为0.85%；所述生理盐水中聚乙二醇所占质量百分比为7%；②将步骤①中所得的上清液与饱和硫酸铵溶液按体积比1:1混合，混合时饱和硫酸铵溶液应徐徐加入上清液中，加以搅拌，4℃静置过夜，10000转/分钟离心20分钟，取其沉淀，将沉淀与无菌的PBS溶液按质量比1:3混合，震荡将其溶解，即为抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体；将该卵黄抗体密封后保存于4℃冰箱中。 

与已有技术相比，本发明有益效果体现在： 

本发明制备抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体为首次公开以异源动物制备鸭黄病毒卵黄抗体，该病毒毒株分离自安徽地区，病毒能够在鸡胚中稳定的传代，针对地方流行的鸭黄病毒病具有更好的保护性。本发明所制备的抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体的制作方法简便稳定，具有较好的免疫及治疗效果，反应温和，应激性较小，在当下暂无商品化抗体的情况下，为解决抗鸭黄病毒抗体的制备提供了新的思路；适用于一定规模的抗鸭黄病毒抗体的生产。 

附图说明

图1是琼脂扩散法对本发明抗鸭黄病毒鸡卵黄抗体效价的测定结果。 

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步解释说明。 

实施例1 

从安徽区域感染鸭黄病毒的病鸭中无菌条件下采集其卵巢等病变组织，将其研磨匀浆后反复冻融三次，12000r/min离心10min。无菌条件下取其上清液，将上清液经0.22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF（即无特定病原体，下同）鸡胚，0.2mL/枚，于38℃孵化箱孵育，弃去24小时内接种死亡的鸡胚，收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，将收获的一代病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚，于38℃孵化箱孵育。收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，获取第二代病毒尿囊液，如此连续传至5代，收获尿囊 液备用。