[发明专利]非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法有效

申请号：	201210167201.1	申请日：	2012-05-25
公开（公告）号：	CN102732612A	公开（公告）日：	2012-10-17
发明（设计）人：	蔡先全;张宪臣;柏建山;朱兴全;邱德义;伍朝晖;简志华;杨洁雅	申请（专利权）人：	蔡先全;张宪臣
主分类号：	C12Q1/68	分类号：	C12Q1/68;C12R1/01
代理公司：	中山市科创专利代理有限公司 44211	代理人：	吴剑锋
地址：	528400 广东***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	标记荧光 pcr 结合 hrm 分析技术检测阪崎肠杆菌方法
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【权利要求书】：

1.一种非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、根据阪崎肠杆菌OmpA基因设计引物对；

B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；

C、应用带HRM模块的荧光PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因型。

2.根据权利要求1所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于所述的阪崎肠杆菌OmpA基因为阪崎肠杆菌外膜蛋白基因A，所述引物对的上游引物序列为：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’，所述引物对的下游引物序列为：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。

3.根据权利要求1所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中是在反应液中进行的，其中制备20μL的反应液由以下组分组成：

4.根据权利要求3所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。

5.根据权利要求4所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。

6.根据权利要求3所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于所述dNTP混合液为由10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP组成的混合液。

7.根据权利要求1或3所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行：

（1）92℃～96℃预变性30s；

（2）92℃～96℃变性10～30s,55-63℃退火10～30s,72℃10～30s,共进行40～50个循环；

（3）72℃延伸10～30s。

8.根据权利要求1所述的非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测阪崎肠杆菌的方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行Tm值和基因型分析，按以下步骤进行：

（1）92℃～96℃变性1min；

（2）40℃复性1min；

（3）然后初始熔解温度60～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。