[发明专利]含HSPA1A启动子与报告基因的重组质粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地说，涉及含有HSPA1A基因的启动子和报告基因的重组质粒及其制备方法和应用。

背景技术

当今世界，癌症日益成为人类健康的一大威胁。据统计，目前世界每年癌症死亡率呈持续上升之势，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，肿瘤的防治一直是医药学工作者所致力研究的一大难题。

近年来光动力疗法正越来越多地用于肿瘤的治疗，成为有效治疗肿瘤的新技术。光动力疗法是一种依托肿瘤组织对光敏剂（通常指卟啉及卟啉类衍生物或拥有一定光物理活性的化合物）的选择性吸收，通过采用适当波长的光源对肿瘤病灶进行照射，引发光化学反应，导致单线态氧（¹O₂）及其他活性氧自由基(ROS)的形成。光诱导形成的ROS能引起氧化应激反应从而导致光敏剂聚集位点的损伤乃至于肿瘤的摧毁。

作为光动力学疗法的主导，光敏剂对于PDT的应用和发展产生了至关重要的促进作用。光敏剂研制开发一直是相关领域研究者关注的焦点。临床用于PDT治疗的光敏剂通常与细胞膜、内质网、线粒体、溶酶体等细胞器膜或其中多个位点结合。由于细胞核不是光敏剂的首要分布位点，所以这种抗肿瘤疗法与传统的化疗或放疗相比，其基因毒性更小。PDT在体内的光损伤及细胞毒性程度，是多个因素决定的，它与使用的光敏剂、亚细胞定位、光敏剂与光照射的处理时间以及不同的光照条件有关。此外，肿瘤的类型及氧化水平也是决定因素之一。

光动力疗法（PDT）所引起的氧化应激能够诱导应激蛋白编码基因的表达，其中包括热休克（hsp）家族蛋白。此类蛋白为高度保守的分子伴侣，在初期蛋白折叠、错叠蛋白重折叠及降解方面起到重要的作用。目前已有大量文献报道热休克蛋白（HSP）基因表达量在细胞应激环境上调。其中HSPA1A基因编码的HSP70蛋白被公认为氧化应激诱导性表达的主要热休克蛋白亚型。

发明内容

本发明的目的是，提供一种含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒；本发明的第二个目的是，提供所述重组质粒的制备方法；本发明的第三个目的是，提供所述重组质粒的一个新应用；本发明的第四个目的，提供一种光敏活性抗肿瘤物质的筛选方法。

为了实现第一个目的，本发明提供的技术方案如下。

提供一种含有HSPA1A基因核心启动子和报告基因的重组质粒，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因pGL3。

为了实现第二个目的，本发明提供的技术方案如下。

一种含有HSPA1A基因核心启动子和报告基因的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）用pGL3-basic质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用KpnⅠ和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；

（2）HSPA1A基因核心启动子序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为：

引物1: 5′ -CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3′  

引物2: 5′ -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3′；

以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用KpnⅠ和HindIII双酶切；

（3）将上述获得的pGL3-basic载体和HSPA1A基因核心启动子片段进行连接反应；

（4）筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。

为了实现第三个目的，本发明提供的技术方案如下。

一种含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用。

作为一个优选方案，用pGL3-HSPA1A-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶pRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。

作为又一个优选方案，所述肿瘤细胞系为宫颈癌细胞系MCF-7。

为实现第四个目的，本发明提供的技术方案如下。