[发明专利]含HSPA1A启动子与报告基因的重组质粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒，其特征在于，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因pGL3。

2.一种根据权利要求1所述的含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用pGL3-basic质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用KpnⅠ和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；

（2）HSPA1A基因核心启动子序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为：

引物1: 5′ - CGGGGTACCGCCTTTCAGGTTCACAATC-3′  

引物2: 5′ -CCCAAGCTTCAATCAGCCGCTTCG-3′；

以人基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用KpnⅠ和HindIII双酶切；

（3）将上述获得的pGL3-basic载体和HSPA1A基因核心启动子片段进行连接反应；

（4）筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。

3.一种根据权利要求1所述的含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用。

4. 根据权利要求3所述的含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用，其特征在于，用pGL3-HSPA1A-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶pRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反映光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。

5.根据权利要求4所述的含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒在筛选光敏活性抗肿瘤物质方面的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞系为宫颈癌细胞系MCF-7。

6.一种光敏活性抗肿瘤物质的筛选方法，其特征在于，利用权利要求1所述的含有HSPA1A基因核心启动子序列和报告基因的重组质粒，即pGL3-HSPA1A-promoter-basic质粒联合海肾荧光素酶pRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应光动力学疗法在细胞内诱导的氧化应激反应程度，从而筛选光敏活性抗肿瘤物质。