[发明专利]一种草鱼出血病抗原蛋白及制备方法和应用

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒，其特征在于：草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，CCTCC NO:V201217。

2.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒制得的一种草鱼出血病抗原蛋白，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，其步骤是：

A. 逆转录草鱼草鱼呼肠孤病毒VP6基因： 

用草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，从中提取病毒总RNA，以总RNA为模板逆转录草鱼草鱼呼肠孤病毒VP6基因；

根据草鱼呼肠孤病毒VP6基因的核苷酸全序列设计一对引物进行逆转录聚合酶链反应，克隆获得VP6蛋白基因；所用的引物序列为：

P1：5’-CGGAATTCATGGCACGTGTGGTTTAT-3’，划线处为 EcoRⅠ酶切位点；

P2：5’-TCCCCGCGGGTGTGGTTACGCGGGTCAG-3’，划线处为SacⅡ酶切位点；

反应条件为：48℃逆转录45分钟；94℃灭活及预变性5分钟；再经94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，反应40个循环；72℃延伸10分钟；

B. 构建酵母表达重组子：

将步骤A逆转录聚合酶链反应产物和pPICZ B载体分别用EcoRⅠ和SacⅡ双酶切，然后在连接酶的作用下使两产物连接，构建成pPICZ B-VP6表达载体，通过聚合酶链反应鉴定和酶切鉴定予以确认；

C. 构建重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌； 

将步骤B中获得的重组子电转入毕赤酵母中，取200μl转化物涂布在ZEOCIN浓度梯度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的YPDS平板上，置30℃恒温培养2～4天，逐级筛选ZEOCIN高抗性菌株，获得目的基因高拷贝重组菌株；

从YPD-ZEOCIN平板上挑取筛选高拷贝菌落接种于100 ml BMGY培养基中，28℃～30℃振荡培养16～18 h，当OD600为2～6时，室温1500 g离心10 min收集细胞，将收集的细胞用20 ml BMMY培养基悬浮于100 ml的三角瓶中，三层无菌纱布扎口，保证良好的通气性，28℃振荡培养诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇浓度至0.5%V/V，并且24 h取样一次，取样量1 ml以保证持续诱导表达；

D. 经分离纯化得到所用的抗原蛋白：收集步骤C中得到的菌液通过冷冻干燥使其变成粉末，用100 μl pH7.4的PBS悬浮使粉末尽量溶解，超声波裂解到菌液呈半透明，经SDS-PAGE电泳后46KDa处即为目的蛋白。

4.权利要求2所述的一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。