[发明专利]纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶及制备酒石酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，以及利用固定化顺式环氧琥珀酸酶生产酒石酸的方法。

背景技术

L型或D型酒石酸是重要的手性拆分剂及化工原料。其中L(+)-酒石酸具有良好的感官特性，可以与柠檬酸、苹果酸等一起添加到果酱、糖果、饮料和葡萄酒中，是重要的食品添加剂。L型或D型酒石酸利用其光学特性还可用作药物工业原料，在现代的有机合成中作为重要的手性配体，可以用来制备许多重要的手性催化剂，并作为手性源用来合成结构复杂的产物分子。另外，酒石酸在化妆品、电镀、制革、纺织等行业也有广泛用途。因此对酒石酸的需求日益增长。

目前生产L型或D型酒石酸主要有以下几种方法：天然植物提取法、化学拆分法、微生物转化葡萄糖发酵法和酶法。酶法是指用价格低廉的顺式环氧琥珀酸作为生产酒石酸的原料，在顺式环氧琥珀酸水解酶(L型或D型)或具有该酶的生物细胞催化下，使原料水解为L型或D型酒石酸。基于酶法制备酒石酸具备转化率高、专一性强、安全性好等优点，其工业化应用价值最高。但是，酶的稳定性不佳，离体纯化的酶极易失活，因此，目前顺式环氧琥珀酸水解酶的大部分应用都是采用完整细胞进行催化。但是利用完整细胞的生物转化是整个细胞中多种酶系同时作用的复杂过程，发酵过程中伴随多种副产物的生成，会影响到反应终产物的分离纯化及最终得率。单独利用固定化的顺式环氧琥珀酸水解酶专一高效生产L型或D型酒石酸具有无可替代的优势和极大的开发潜力。

发明内容

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，以及利用固定化顺式环氧琥珀酸水解酶生产酒石酸的方法。

本发明的技术方案是：纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的方法，包括以下步骤：

(1)在编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物结合模块CBM30，得到融合表达载体；

(2)将融合表达载体转化到大肠杆菌中，高效可溶性表达融合蛋白，得到目标菌体；

(3)采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤目标菌体并重悬细胞，将重悬细胞进行破碎，离心得到粗酶液；

(4)将粗酶液与纤维素混合，离心得到沉淀，采用pH为7.4的磷酸盐缓冲液淋洗沉淀并再次离心，所得沉淀即为目标产物固定化酶。

优选的是，所述步骤(2)包括以下步骤：a.细胞培养：将大肠杆菌置于培养液中，在37℃下培养至OD600为0.8-1.0；b.诱导表达：加入IPTG至其浓度为0.2mM，25℃的温度条件下诱导培养8小时；c.离心，收集菌体。

优选的是，所述步骤(3)破碎目标菌体可以采用高压细胞破碎、超声破碎或者溶菌酶破碎中的任意一种。

优选的是，所述步骤(3)中的离心操作是在4℃，以10,000rpm的转速离心20min。

优选的是，所述步骤(4)中所述纤维素与粗酶液中酶的质量比为1∶0.005-1∶0.02。

采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法，包括以下步骤：将纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶加入顺式环氧琥珀酸的溶液中，在pH为5-11，温度为25-70℃的条件下反应，即得到目标产物。

优选的是，所述纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶为D型时，所述反应体系中还含有0.1mM-10mM的Zn²⁺，所得目标产物为D型酒石酸。

优选的是，制备L型酒石酸反应的最佳反应温度为30-50℃，最佳反应pH为8-10；制备D型酒石酸反应的最佳反应温度为30-50℃，最佳反应pH为5-9。

本发明的有益效果是：本发明利用纤维素作为固定化的基质，使用对纤维素具有特异的吸附作用的碳水化合物结合模块CBM30作为亲和标签，对顺式环氧琥珀酸水解酶进行融合表达并制备得到固定化酶，与非固定化的酶相比，有以下优点：(1)固定化酶的同时提高了酶的纯度，改善了酶的性能，提高了酶的稳定性；(2)纤维素是一种安全的生物大分子，价格低廉，来源广泛，具备巨大的经济前景；(3)固定化酶的反应体系杂质少，有利于产物的纯化和分离，不存在底物及产物跨膜运输效率的问题。

与利用完整细胞进行的生物转化相比，采用纤维素固定化顺式环氧琥珀酸水解酶制备酒石酸的方法具有反应具备特异性，产品纯度高，反应效率高等优点。

具体实施方式

1.纤维素固定化L型顺式环氧琥珀酸水解酶

(1)在编码顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N端或C端融合碳水化合物结合模块CBM30，得到融合表达载体；