[发明专利]预防人参重茬病益生菌菌剂的制备方法

说明书

所属技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种能够预防人参重茬病益生菌菌剂的制备方法。

背景技术

在人参人工大量种植的今天，由于大量使用化肥、农药，使得土壤-微生物-植物根-形成的土壤生态系统受到严重破坏，有益菌受到抑制，而致病的真菌，如锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、人参链格孢(Alternaria panax)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉

菌(Pythium rostratum)等，得到漫延生长，致使人参频繁发生重茬病，如根腐、枯萎、黄苗、花叶、黑斑等，使得新开垦的森林土在种植4-5年(一茬)人参后，不能再重复利用，一般需要经过十年以上的自然修复才能再种植人参。因此，能种植人参的土地越来越少。对人参重茬病的传统防治方法有化学防治和种植措施防治。近年来，由于传统的种植措施防治方法不能从根本上控制病害的发生，防治效果往往不稳定；而长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，过量使用农药也会破坏土壤的微生态环境，加重农药对环境的污染，造成有害有毒物质在作物体内残留过高的恶果。采用微生物菌剂防治方法研究越来越受到人们的重视。从修复土壤生态系统入手，增加土壤中的有益菌，从而抑制那些容易感染植株病害的细菌和真菌。采用细菌-真菌联合、多菌种联合的技术方法，达到修复土壤生态系统，防止根腐病、枯萎病等重茬病发生，同时促进根生长，松土壮苗。益根生菌剂还具有降解农药、化肥残留污染的作用。菌剂经发酵工程完成后有效活菌数(cfu)在20亿以上即2-3×10⁸cfu/g。采用细菌-真菌联合预防人参重茬病益根生菌菌剂及其高密度、高活性的生产工艺还未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种高密度、高活性的预防人参重茬病益生菌菌剂制备方法。

本发明的技术设计构思是：

抗重茬益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂生产的菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的灭菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)，多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacillus polymyxa)，粪链球菌CGMCC1.101(Streptococcus faecium)，热带假丝酵母CGMCC2.1397(Candida tropicalis)，淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)，细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)，金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)等8株菌。将发酵终产物吸附、固定化于草炭上制成的菌剂。

本发明中所用菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。无毒、无害，对土壤环境友好。用这些菌去修复遭到破坏的土壤生态系统，与原土壤的有益菌共同形成新的生态平衡。

各菌的培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。

灭菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。

所述的发酵过程包括下列工艺步骤：

A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶逐级扩大培养制成一级种子液(每株菌各600mL)；

B、将A步骤中制备的一级种子液进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子液；

C、将B步骤中制备的二级种子液转接于三级扩大培养液：以5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧混合发酵制成发酵终产物；

其中步骤B、C的发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m³/h、搅拌转速为200-300r/min。