[发明专利]一种植物组织中H2S的化学染色方法

说明书

技术领域：

本发明涉及植物组织化学染色方法，具体是一种植物组织中H₂S的化学染色法,该方法可以对植物组织内的H₂S做定性和半定量分析。

背景技术：

硫化氢（H₂S）作为一种有毒气体，人类认识和研究其作用已有300多年的历史。直到20世纪90年代中期，人们才发现H₂S是存在于生物体内的一种新型的内源性气体信号分子，所以H₂S被认为是继NO和CO之后的第三种气体信号分子。在动物体中是一种新的内皮细胞源性血管舒张因子,在平滑肌松弛、海马长时程增强、脑发育和炎症等方面发挥着重要的生理病理作用。在植物中，H₂S也能够作为信号分子调控多种生理过程，响应生物和非生物胁迫，研究发现外源H₂S可促进植物种子萌发和根系发生，调节和控制气孔运动，而且可以缓解重金属毒害、渗透胁迫、冷冻胁迫对植物的影响。因此H₂S对生物的生理作用和它的信号转导机制正在成为生物领域的研究热点。

对于H₂S在生物体中的作用研究才刚起步，国内外H₂S在组织细胞中的定位只有利用荧光探针的方法。这种探针仅见于研制成功的文献报道，还没有生产和应用；且荧光探针应用成本高，对实验条件要求也高。

发明内容：

本发明的目的是建立一种简便，易行，效果良好的植物组织中的H₂S化学染色方法，从而为H₂S在植物组织中的显色定位以及半定量分析提供一种有效的研究方法。

本发明的显色原理和方法设计是根据H₂S的化学性：CuSO₄+H₂S=CuS↓(黑色沉淀)+H₂SO₄，且CuS沉淀不溶于水、乙醇，仅溶于硝酸。植物组织中H₂S的产生富集区域经CuSO₄溶液处理后会有黑褐色沉淀产生，反之在没有H₂S生成的区域则没有沉淀产生。

本发明提供的一种植物组织中H₂S的化学染色方法，包括如下步骤：

取植物叶片浸泡于8-10%CuSO₄溶液中，6-10小时后取出叶片用蒸馏水洗净，放入95%乙醇中煮30-40分钟或放入95%乙醇中60℃水浴10-12小时，脱去叶绿素，取出叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察，叶片上呈现黑褐色斑点。可根据叶片上呈现黑褐色斑点的多少，判断植物组织H₂S含量的多少。

与现有技术相比，本发明是一种成本低廉、操作简便的H₂S植物组织化学染色方法，它可以特异地显示出植物组织中H₂S的定位，并可以依据叶片上沉淀形成的黑褐色斑点数量对H₂S在组织中的含量进行半定量分析。

附图说明：

图1是拟南芥叶片局部放大照片(放大倍数180×)

图2是x射线光电子能谱（XPS）分析叶片黑色颗粒密集区的结果

a:叶片黑色颗粒密集区XPS全谱

b:Cu2p的能谱

c:S2p的能谱

图3是拟南芥叶片PEG模拟干旱胁迫12小时后硫酸铜染色6小时的结果，图中：

A：乙醇脱色 B：CuSO₄+乙醇脱色 C：5%PEG+CuSO₄+乙醇脱色 D：10%PEG+CuSO₄+乙醇脱色 E：20%PEG+CuSO₄+乙醇脱色 F：40%PEG+CuSO₄+乙醇脱色

图4是拟南芥叶片Cd胁迫12小时后硫酸铜染色6小时的结果，图中：

A：乙醇脱色 B：CuSO₄+乙醇脱色 C：10mMCdCl₂+乙醇脱色 D：1mMCdCl₂+CuSO₄+乙醇脱色 E：5mMCdCl₂+CuSO₄+乙醇脱色 F：10mMCdCl₂+CuSO₄+乙醇脱色

具体实施方式：

以下给出本发明的非限定实施例。

实施例1．