[发明专利]一种新型单宁酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从海底淤泥宏基因组文库中分离筛选到的一个新型单宁酶基因、异源表达及其应用。

背景技术

在茶饮料的生产过程中，茶叶的高温提取液冷却后会变浑浊，并产生絮状沉淀(茶乳酪)，这严重影响了茶饮料的口感和香气。茶乳酪的形成过程为：温度较高时，茶提取液中的茶多酚及其氧化物、咖啡碱、蛋白质以及脂质等物质均以游离态存在，随着温度的降低，茶汤中多酚类(尤其是茶黄素、茶红素及没食子酸酯等)分别与咖啡碱的酮氨基、蛋白质的肽基氢键结合形成络合物，逐渐发生凝聚而沉淀下来。在茶饮料生产过程中，需要采取物理、化学或酶处理的方法来消除茶乳酪或使之形成可溶物。用来去除“茶乳酪”的方法有物理法、化学法和酶法。其中，由于酶法较物理法和化学法具有经济、高效和无二次污染等优点，成为当今的主要研究热点。

近些年来，利用纯培养技术已从环境中筛选到能产生单宁酶的微生物，但种类非常有限，主要集中在真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，并且筛选到的这些微生物酶量极少，酶活性也不高，造成生产成本的增加。于是，有研究者从已筛选到的这些微生物中(如米曲霉和植物乳酸杆菌)克隆单宁酶基因，然后将其在工程菌中表达。但是，这些重组降解酶的稳定性较差，在实际应用中有一定的局限性。到目前为止，所有的关于单宁酶的研究都是针对于环境中可培养微生物来展开的。我们知道，环境中蕴藏着大量的微生物资源，并且这些微生物中超过99％的微生物难以通过传统的微生物分离培养的方式进行研究，所以，传统的微生物分离培养技术已经大大的限制了人们对可产生单宁酶的微生物自愿的利用和开发。宏基因组学的出现，则解决了这方面的问题，因为它避开了环境微生物分离培养的难题，直接从环境样品中提取基因组总DNA，建立宏基因组文库，进而从中筛选新的基因或生物活性物质。宏基因组文库包含了环境中所有的(可培养的和不可培养的)微生物遗传信息，因此，在挖掘和利用环境中那些不可培养微生物资源方面，有着巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术从环境中成功的筛选到了如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶/脂肪酶等新基因，并且这些酶具有一些新酶学特性及工业应用潜力。到目前为止，尚未利用宏基因组技术从环境中筛选单宁酶基因的研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的提供一种新型单宁酶及所述新型单宁酶的cDNA。

本发明的第二个目的是提供一种上述新型单宁酶的宏基因组学的克隆方法。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述单宁酶cDNA的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种利用上述表达载体构建的重组单宁酶及其制备方法，以及所述重组单宁酶的应用。

为实现本发明的第一个目的，采取的技术方案为：一种新型单宁酶，所述单宁酶的氨基酸序列如如SEQ ID NO.3所示。

一种上述新型单宁酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为实现本发明的第二个目的，采取的技术方案为：一种上述新型单宁酶的宏基因组学克隆方法，包含以下步骤：提取南海海洋淤泥总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切处理后，连接到pUC118载体上，电击转化导入大肠杆菌DH5α中建立宏基因组文库，通过高通量筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

为实现本发明的第三个目的，采取的技术方案为：一种包含如上所述的新型单宁酶的cDNA的表达载体。

为实现本发明的第四个目的，采取的技术方案为：一种重组单宁酶的制备方法，包括以下步骤：用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组单宁酶。

优选地，上述所述重组单宁酶的制备方法中，所述寄主细胞是大肠杆菌。

优选地，所述重组单宁酶的制备方法具体包括以下步骤：用权利要求4所述的目的片段经BamHI和HindIII双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。

优选地，上述所述重组单宁酶的制备方法中，所述的IPTG终浓度为0.4mM，诱导温度为25℃。

一种采用如上所述方法制备得到的重组单宁酶。

一种上述所述的重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、单宁酸、素儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。所述重组单宁酶对儿茶素及其它底物有降解作用。

本发明的有益效果为：