[发明专利]神经生长因子活性定量测定方法有效

申请号：	201210125986.6	申请日：	2012-04-26
公开（公告）号：	CN103376248A	公开（公告）日：	2013-10-30
发明（设计）人：	谭淑萍;蒋立新;周志文	申请（专利权）人：	舒泰神(北京)生物制药股份有限公司
主分类号：	G01N21/64	分类号：	G01N21/64
代理公司：	北京银龙知识产权代理有限公司 11243	代理人：	钟晶;於毓桢
地址：	100176 北***	国省代码：	北京;11
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摘要：
搜索关键词：	神经生长因子活性定量测定方法
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【说明书】：

技术领域

本发明涉及一种神经生长因子活性定量测定方法。

背景技术

神经生长因子(以下简称NGF)的活性测定，目前业内采用的方法为鸡胚背根神经节法。传统的鸡胚背根神经节法是依据NGF诱导神经节生长、刺激轴突生产的特点而建立，具有特异性强等优点，但该方法检测每个浓度的NGF需要分离多个神经节，因不是分离后的每个神经节均能受刺激生长轴突，生长轴突的程度也并非一致，只要多个神经节中出现一个终点刺激效应者就可判定效价，操作繁琐、试验周期长、结果主观判定不能定量、重复性差，已不适于对该制品的质控要求，同时其作为一种半定量的方法，也存在一定局限性。

随着NGF在临床上的应用不断增加，生产规模不断加大，如何快速、简便且高通量地检测NGF生物活性成为其质量控制的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较好的准确度和精密度的NGF活性定量测定方法。

本发明所提供的NGF活性定量测定方法，包括以下步骤：

1)将处于对数生长期的TF-1细胞用不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基洗涤后重悬，获得TF-1细胞悬浮液；

2)向梯度稀释的神经生长因子标准品和待测样品中分别加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO₂孵育；然后分别加入指示剂，检测吸光度/荧光值，绘制标准曲线；

3)通过标准曲线及样品的吸光度/荧光值计算待测样品的神经生长因子活性浓度。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述步骤1)中获得的所述TF-1细胞悬浮液还经过在37℃、5％CO₂条件下培养18-20h的步骤。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述处于对数生长期的TF-1细胞通过在完全培养基中37℃、5％CO₂条件下培养获得。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述完全培养基为含体积百分含量10％的胎牛血清以及10ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640培养基。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述神经生长因子为鼠神经生长因子或人神经生长因子。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述指示剂为MTT、MTS或AlamarBlue。MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。MTS是其类似物，全称为[3-(4，5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazol iuzolium，inner salt]。

优选地，所述加入指示剂为AlamarBlue。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，加入所述指示剂后，在37℃孵育，然后激发光560nm/发射光590nm检测荧光值。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述TF-1细胞悬浮液的浓度为1.5～2.5×10⁵细胞/ml。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述TF-1细胞悬浮液的浓度为2×10⁵细胞/ml。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述梯度稀释的样品中NGF活性浓度为5～20AU/ml。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，所述不含血清和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基础培养基优选为RPMI 1640培养基。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，步骤1)中所述用不含血清的基础培养基洗涤的方法为：750rpm离心5min，换液后重复离心，优选重复洗涤3次。

本发明的NGF活性定量测定方法，其中，步骤2)中加入所述TF-1细胞悬浮液，37℃、5％CO₂孵育44～52h，优选为48h。

本发明的NGF活性定量测定方法，具有较好的准确度和精密度。

附图说明

图1表示实施例1中绘制的标准曲线。

图2表示实施例1中样品稀释倍数与活性之间的稀释曲线。