[发明专利]抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

甲鱼系统性败血症球状病毒（Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV）是从发病甲鱼中分离的一种新型病毒。毒株为P1015株，保藏号为 CGMCC No.5378，于2011年10月21日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒无囊膜，直径23-40nm，细胞核内、外均可增殖。该病毒能导致甲鱼系统性出血、败血，来势猛，7-10天内累积死亡率可达90-100%。2005年来，浙江宁波等地区中华鳖生态养殖场发生的暴发性败血症多由该病毒所致，常规药物治疗无效，给养殖户造成巨大经济损失。目前，该病尚处于研究初始阶段，无有效治疗方法，部分养殖户滥用抗生素进行防治，非但没有疗效，反而破坏了生态环境，使其他病原生物产生耐药性，造成并发性疾病，给该病的防治增加了压力。鉴于此，寻找一种高效、绿色的甲鱼系统性败血症治疗方法势在必行。 

卵黄抗体（IgY）是从经抗原免疫的禽类所产卵中分离的具有特异性的蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产的廉价抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的特异性IgY的量（约200mg）远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量。IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。高效卵黄抗体可以通过注射、拌饵投喂、浸泡等方式对水产动物起到保护剂疾病治疗作用，还可用于免疫学检测等领域。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，如防治传染性法氏囊病、禽流感、新城疫等疾病。但在水产行业的研究开发还处于基础阶段，目前在水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒病、抗贝氏隐孢子虫病、抗副溶血弧菌病以及抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体，但是，目前还没有关于抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体及其制备方法和应用的相关研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒（STSSSV）的卵黄抗体及其制备方法和应用，该卵黄抗体纯度高，且对甲鱼系统性败血症球状病毒有较强的抑制作用，其制备方法简便易行，可用于STSSSV引起的疾病的预防和治疗上及开发STSSSV检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体，采用甲鱼系统性败血症球状病毒为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到所述的抗甲鱼系统性败血症球状病毒的鸡卵黄抗体粗提物，纯化后得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体纯品。 

一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 

（1）抗原制备

选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃ ，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原；

（2）动物免疫

将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；

 （3）特异卵黄抗体的分离和纯化