[发明专利]一种利用愈伤组织再生途径快速繁殖黄檗的方法

说明书

技术领域：

本发明是一种通过愈伤组织再生途径快速繁殖黄檗的方法，操作简单且周期短，不定芽再生频率高，繁殖速度快。本发明属于农业生物技术领域。

背景技术：

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)属芸香科(Rutaceae)黄檗属，是我国东北地区三大珍贵阔叶树种，是重要的药用植物和用材树种，为第三世纪古热带区系孑遗植物，是国家二级保护渐危种(范继红，2006)。黄檗体内重要的次生代谢产物小檗碱是传统中药黄连的主要有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫力等功效。黄檗的木材可用来制作家具和工艺品，而且是工业用软木塞和黄色染料的来源。黄檗的商业开发和传统的无性繁殖由于黄檗种子育性差，较低的萌发率和扦插繁殖较差的生根能力而受到限制(Mukai and Yokoyama，1985)，而组织培养能够有效地解决这个问题，通过愈伤组织再生途径大量繁殖黄檗是药用植物快速增殖的有效途径(Castillo and Jordan，1997)。

目前在黄檗的组织培养方面研究相对较少，采用黄檗的种子为外植体(赵波，东北林业大学硕士学位论文，2007)已见研究报道，但采用种子为外植体处理起来比较麻烦，因为每次外植体都需要灭菌处理，如果灭菌不彻底，容易引发外植体大批污染。而本发明以黄檗无菌苗茎段为外植体，外植体取材容易且比较方便，操作简单，再生周期短，能够在短期内获得大量的再生苗木，为黄檗的快速繁殖和利用基因工程育种打下很好的基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一种更简单高效、操作方便地以黄檗无菌苗茎段为外植体通过愈伤组织再生途径快速繁殖黄檗的方法，为解决黄檗资源紧缺提供大量优质资源，该发明为黄檗分子育种及规模化生产奠定基础。

本发明主要是涉及利用黄檗无菌苗茎段为外植体，通过愈伤组织再生途径获得无菌苗的方法，主要包括外源生长调节物质，培养基组成，碳源种类及组成等。提供了利用黄檗无菌苗茎段为外植体，利用愈伤组织再生途径，建立快速高效的黄檗茎段离体再生系统。

具体技术路线包括以下几方面内容：

1、黄檗无菌苗获得：

材料来源于东北林业大学实验林场黄檗休眠芽，取休眠芽，经常规方法灭菌以后，将休眠芽接种在MS+BA1.0mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l的培养基上。约一个半月左右可获得黄檗的无菌苗。

2、黄檗茎段愈伤组织诱导和不定芽再生

将黄檗茎段培养在含有不同BA和NAA的MS培养基上，发现最佳的培养基为MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.5mg/l+葡萄糖20g/l+琼脂6.0g/l，不定芽的再生频率为75.4％，平均出芽数为14.7。

3、不定芽的继代增殖和扩繁

将获得的不定芽转移到继代增殖培养基MS+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l上，获得的不定芽仍保持较高的增殖系数，平均每个月的增殖系数为3.4。

4、不定芽的生根和移栽

将不定芽培养在生根培养基1/4MS+IBA0.8mg/l+蔗糖20g/l+琼脂6.0g/l的培养基上，半个月左右开始有不定根出现，约3周左右，对生根的不定苗进行移栽，移栽的基质为沙子和泥炭土1∶1，移栽成活率为100％。

本发明所使用的培养基都是按照常规的方法处理的，pH值均为5.8，高温高压(121℃，1.5个大气压)15min后使用的。

本发明的培养室是在常规的组织培养室(温度25℃左右，光照1000～1500lux，光/暗周期16h/8h，湿度70％左右)中进行的。

本发明的技术特征：.

1)适合黄檗茎段愈伤组织诱导和不定芽再生的最佳生长调节物质为BA1.5mg/l和NAA0.5mg/l。

2)适合黄檗茎段愈伤组织诱导和不定芽再生的最佳碳源为葡萄糖20g/l。

3)适合黄檗不定芽继代增殖的最佳生长调节物质为BA0.5mg/l。

4)外植体容易获得，操作简单。

5)移栽成活率高。

6)可以源源不断地获得黄檗的再生苗。

具体实施方式：

实例1黄檗茎段愈伤组织诱导和不定芽再生

1)材料来源

材料来源于黄檗无菌苗的茎段。

2)黄檗无菌苗的获得