[发明专利]自目标多核苷酸和非目标多核苷酸的混合物富集目标多核苷酸或非目标多核苷酸的方法和组合物

说明书

提供了从非目标和目标多核苷酸的混合物富集非目标多核苷酸的组合物和方法，其中目标多核苷酸与非目标多核苷酸之间的差异包括修饰碱基的程度，其以比在非目标多核苷酸中更大的密度存在于目标多核苷酸中。这使目标多核苷酸选择性地和快速地结合至亲和基质如亲和蛋白质涂布的磁珠，在上清液中提供非目标多核苷酸的富集。该富集的一种应用是从得自人组织样本的DNA混合物去除人基因组DNA以富集微生物多核苷酸，从而通过DNA测序表征微生物。

背景

病毒、细菌、酵母菌和真核多细胞生物在自然界可以以复合群丛共存。该类型群丛的实例是微生物，其寄居于哺乳动物宿主中。快速DNA测序技术已被用于考察微生物。关于样本中哺乳动物基因组DNA的存在和含量——其影响信噪比——的不确定性不利地影响物种识别的准确性。这在目标DNA以极少量存在于高本底宿主基因组物质中的情况下特别有问题。

Zhigang Wu，等(Lab Chip，9：1193-1199(2009))开发了微流体装置以将细菌细胞与人血液细胞物理分离，其基于柔和惯性力引起的迁移，利用微流体装置中流动限定的、曲线的和聚集的样本流动，导致细菌300倍富集。此细胞分离类型仅可减少两种细胞类型之间的DNA本底污染——如细胞可存活。

用于分离血液中脓毒症致病细菌DNA的另一方法取决于用离液剂选择性裂解人有核细胞(MolYsis，Molzym GmbH，Bremen，Germany)。该方法还取决于活细胞。利用抗盐DNA酶降解裂解的细胞中的人DNA，而DNA酶不影响完整的细菌细胞。然后将DNA酶灭活，提取和提纯细菌DNA用于分析。该技术使样本中的人DNA总浓度降低99.5％。但是，细菌DNA的总回收率很低，仅为预期总量的30％(Horz，等，Anaerobe 16：47-53(2010))。

在目标DNA的损失最小化和不要求活细胞是DNA来源的条件下，目前没有从包含DNA混合物的环境样本富集目标DNA的令人满意的方法。

概述

在本发明的实施方式中，提供了这样的组合物：其包含大小各自在10-100kb范围内的非目标多核苷酸和目标多核苷酸的混合物。该组合物还包含基质，该基质涂布有蛋白质或多肽结构域以形成亲和基质。该亲和基质的实例包括选自UHRF1(SRA)、CXX1、DNMT1、MBD或其甲基结合变体的甲基结合结构域(MBD)。这些甲基结合蛋白质可借助融合于MBD——其结合涂布于基质上的蛋白质A——的Fc部分连接于基质。该基质的实例包括磁珠。

亲和基质选择性地结合包含修饰碱基——例如碱基是甲基化的胞嘧啶——的目标多核苷酸。修饰碱基可以200个碱基中至少1个修饰碱基的频率存在。组合物进一步包含缓冲液，该缓冲液包含有效量如10mM-800mM的盐和非离子型洗涤剂。

在本发明的实施方式中，提供了从混合物富集核苷酸的方法，包括：(a)得到上述组合物；(b)使目标多核苷酸结合亲和基质；和(c)在上清液部分得到非目标多核苷酸的富集制备物。

在上述方法的进一步实施方式中，上清液中的非目标多核苷酸由富集前混合物中至少90％的非目标多核苷酸组成，和/或上清液中的目标多核苷酸由富集前混合物中不高于10％的目标多核苷酸组成。

在上述方法的进一步实施方式中，富集前多核苷酸混合物得自生物样本，包含原核生物和哺乳动物基因组DNA，其中混合物包含至少50％哺乳动物基因组DNA。

在上述方法的进一步实施方式中，通过测序、克隆或扩增分析上清液中的非目标多核苷酸以确定非目标多核苷酸的基因组同一性。

在本发明的进一步实施方式中，提供了增强包含与鸟嘌呤相邻的甲基化的胞嘧啶(CpG)的多核苷酸与未甲基化的多核苷酸分离的方法，包括：提供上述组合物，其中修饰碱基是甲基化的CpG；使CpG-甲基化的多核苷酸结合亲和基质，以形成固定化在基质上的产物；和对结合多核苷酸或未结合多核苷酸中的至少一种进行扩增和/或测序。