[发明专利]一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法。

背景技术

纤维素、几丁质是自然界含量最为丰富的多糖，蕴含着巨大的生物可利用资源，它们均由吡喃葡萄糖经β-1，4糖苷键连接而成，不同点在于2号碳上所连接的基团。其中几丁质是由D-乙酰氨基葡萄糖残基构成，在自然界中，真菌、昆虫等体内含量极为丰富。科学界十分关注几丁质、壳聚糖及其水解物，因为它们具有许多重要和有开发潜力的生物学功能，比如杀菌、抗癌等，有些功能已经被实际应用于农业、食品和医药产业。

几丁质酶(EC 3.2.1.14)是自然界存在的一类能够催化水解几丁质β-1，4糖苷键的酶类，其存在细菌到真菌，甚至病毒乃至植物中。根据其氨基酸序列分析，几丁质酶可分为18号和19号二个家属，不同家属的酶对底物的特异性、作用方式是不同的。

相对于物化方法水解几丁质，酶法水解具有节能、环保、高效、安全、低成本等无可比拟的优势，能够为几丁质原料的食品、制药等行业提供优质产品。该课题的关键在于几丁质酶基因的克隆方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从产几丁质酶的菌株中快捷克隆几丁质酶基因的方法。

本发明所述的方法包括如下步骤：

(1)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列；

(2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物；

(3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段；

(4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物，通过sitefinding PCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。

几丁质酶可分为18号和19号两个家属，通过氨基酸序列分析可找出GH18家属的核心保守序列。比对已知的GH18家属的几丁质酶基因，找出其保守序列SIGGWT，FDGIDID和NIMTYD，设计半嵌套简并引物。也可利用软件Block Maker(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html)进行比对和寻找保守区域，然后利用软件CODEHOP(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html)寻找可能的简并引物。依据引物的基本原则和要求：简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的Tm值尽可能相近等，选择适宜的简并引物。

根据上述原则，发明人设计了三条简并引物：

GH18FP 1：5’-AGYATHGGNGGNTGGCA-3’；

GH18FP2：5’-TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’；

GH18RP：5’-TCRTANGTCATDATRTT-3’；

利用只含几丁质作为唯一碳源的特殊选择性培养基可获取产生几丁质酶的菌株，并抽提其基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板进行PCR。对扩增得到的部分基因片段(250-280bp)进行测序，然后根据获得的各种几丁质酶基因片段的序列设计各自特定的嵌套引物FP1、FP2和RP1、RP2。其中，FP1、FP2和RP1、RP2是根据所述步骤(3)扩增得到的特异几丁质酶基因片段(250-280bp)序列设计的，每种几丁质酶基因其引物FP1、FP2、RP1和RP2可根据特异几丁质酶基因片段序列做相应调整。

以各细菌的基因组DNA为模板，进行单一酶切与自身环化，然后利用FP1与RP1引物进行反向PCR，再以所得扩增获得的产物作为模板，利用引物FP2和RP2进行嵌套PCR。或者利用SFP1(5’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’)与FP1(或RP1)引物进行Sitefinding PCR，再以所得扩增获得的PCR产物作为模板，利用引物SFP2(5’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’)与FP2(或RP2)进行嵌套PCR。对获得的几丁质酶基因片段上下游序列进行移步扩增，并对所获得的基因片段进行测序、基因拼接。

根据测序、拼接的结果，和现有几丁质酶基因进行比对，根据同源性等的分析，可以获得新型的GH18家属几丁质酶基因。