[发明专利]一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法

权利要求书

1.一种从产几丁质酶的菌株中克隆几丁质酶基因的方法，包括如下步骤：

(1)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列；

(2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物；

(3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段；

(4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物，通过sitefinding PCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中核心保守序列为SIGGWT，FDGIDID和NIMTYD。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中简并引物为：

GH18FP 1：5’-AGYATHGGNGGNTGGCA-3’；

GH18FP2：5’-TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’；

GH18RP：5’-TCRTANGTCATDATRTT-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中的嵌套引物FP1、FP2和RP1、RP2是根据所述步骤(3)扩增得到的特异几丁质酶基因片段(250-280bp)序列设计的，每种几丁质酶基因其引物FP1、FP2、RP1和RP2可根据特异几丁质酶基因片段序列做相应调整。

5.一种几丁质酶蛋白，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：

(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.3所示序列一致；

(2)、将Seq ID NO.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由(1)衍生的蛋白质。

6.编码权利要求5所述几丁质酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或为对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留几丁质酶蛋白生物学活性的DNA分子。

7.携带有权利要求6所述DNA分子的载体。

8.一种宿主系统，其由权利要求7所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

9.根据权利要求8所述的宿主系统，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主系统，其为大肠杆菌E.coli。