[发明专利]一种高效提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法

权利要求书

1.一种高效提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用CTAB、PVP、CaCl₂、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法；取5g桑树根围土样，加入13.5mL DNA提取液III和少许石英砂，漩涡振荡器震荡3min；加入150μL 100mg/mL溶菌酶、15μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K 15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提，酚/氯仿/异戊醇体积比25∶24∶1，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇再次抽提，氯仿/异戊醇体积比24∶1，8500r/min离心10min，取上清液；在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/L NaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存；即获得桑树根围土壤微生物总DNA。

所述DNA提取液III成分为Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na₃PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl₂，1μg/mL BSA，2％PVP；pH 8.0；pH 8.0所述的土样，采自采样桑树根围土壤深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存。

2.如权利要求1所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于：该方法在进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成、结构多样性及其生态功能。