[发明专利]一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法

权利要求书

1.一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述的方法具体为PVP预处理-CTAB、CaCl₂、BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法，取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液II和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/L NaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存；即获得桑树根围土壤微生物总DNA。

所述DNA提取液II成分为Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na₃PO₄100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl₂，1μg/mL BSA；pH 8.0。所述的土样，采自桑树根围土壤，深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存。

2.如权利要求1所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于：该方法在进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成、结构多样性及其生态功能。