[发明专利]一种基因拷贝数的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因拷贝数的定量检测方法。

背景技术

近年来的研究发现，基因拷贝数变异(copy number variants, CNVs) 和单核苷酸多态性(SNPs)一样，是分子进化和遗传多态性的重要遗传标志，也是某些疾病的发病分子基础，当前越来越多的CNVs被发现并提交到相应的分子生物学数据库。

就分子机制而言，CNVs的实质是一段DNA序列的拷贝数变化。某一个体的一套基因组DNA中，正常情况下某等位基因的拷贝数为2个，如果两条染色体上的此基因均缺失则拷贝数为0，如果其中1条染色体上缺失则拷贝数为1，如果其中1条染色体上于此基因序列后又有1段此基因序列则拷贝数为3（常称之为多拷贝），如果2条染色体均出现此基因的重复序列，则拷贝数为4等。由于基因拷贝数的差异，往往直接导致所编码蛋白表达量及表达水平的变化，从而导致一系列的生物学效应。就人类而言，CNVs不仅可以为人类进化研究提供信息，且CNVs所导致的生物学效应，涉及到药物敏感性、药物治疗靶点、疾病的发病机制分析、疾病诊断标志物、疾病治疗疗效评估等众多领域，因此，基因CNVs检测有着非常重要的实际意义。

基因拷贝数变异可分为基因缺失和基因多拷贝。当前的检测技术方案主要为针对基因缺失及多拷贝分别进行检测与分析，也就是采用一套技术方案检测基因缺失，采取另一套技术方案检测基因多拷贝。目前，检测基因缺失的主要技术是跨越断裂点PCR（gap-PCR）技术；检测基因多拷贝的技术报道较少，比较典型的为采用长片段PCR扩增检测基因三联体（如珠蛋白基因α1和/或α2）。最近，MLPA技术（多重连接探针扩增技术Multiplex ligation-dependent Probe amplification）的开发与应用，虽然能同时检测基因缺失和基因多拷贝，但其检测成本高、操作繁琐、需要特殊的仪器设备等技术限制，不适合常规使用。因此，开发一种准确稳定、简单实用，能同时检测基因缺失和基因多拷贝的常规技术与方法，是当前的迫切需要。

生物体基因组中的看家基因（house-keeping gene，如哺乳动物的β肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因等），已证实其没有拷贝数变异，即1套基因组中，其无论在什么情况下都是2个拷贝。根据定量PCR的技术原理，结合基因缺失和基因多拷贝的拷贝数变化规律，可以获知：当HKG和受检功能基因的均为正常的2个拷贝，且2个PCR反应的扩增效率均为100%，则两者扩增达到一定产物量的循环数相等，即Ct值相等，Ct值差异为0；如果功能基因缺失了1个，则其扩增达一定产物量较HKG多1个循环，即Ct值差异为1；如果功能基因为3个拷贝，则其扩增达一定产物量较HKG少0.27个循环，即Ct值差异为-0.27；如果功能基因完全缺失（拷贝数为0），就不会有其扩增曲线及Ct值。

根据上述规律，结合目前广泛应用的多重TaqMan实时定量PCR技术，通过体系优化及调整，其分析灵敏度可达到的Ct值差异为0.8～1.0，故能准确检测功能基因0、1、2拷贝，但不能准确分析Ct值差异仅为0.27的3个拷贝，故多重TaqMan实时定量PCR技术也存在一定的局限性。因此，如果能发明有效的技术与方法，使功能基因缺失和多拷贝所导致的Ct值差异增大，以达到定量PCR技术的灵敏度有效范围，也就能应用定量PCR技术实现基因缺失和多拷贝的同时快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因拷贝数的定量检测方法。

本发明所采取的技术方案为：

一种基因拷贝数的定量检测方法，包括如下步骤：

1)  分别选取目的基因、参比基因的扩增序列；

2)  分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针，及目的基因扩增序列的封闭探针，封闭探针包括上游封闭探针和下游封闭探针；

3)  样本检测：以待检DNA样本作为模板，对目的基因和参比基因进行多重TaqMan荧光定量PCR反应，并以目的基因拷贝数已知的DNA样本为对照样本，分别记录Ct值；

4)  结果分析：计算待检样本目的基因的拷贝数相对定量值，判断分析检测样本目的基因的拷贝数。

优选的，封闭探针的3’末端经过修饰失去了延伸能力。

优选的，目的基因的引物、封闭探针分别与目的基因的结合位点相同。

优选的，目的基因、参比基因的引物的5’末端分别引入了4～7bp与基因组模板非互补的碱基序列。

优选的，封闭探针比目的基因的引物的Tm值高3～5℃。