[发明专利]一种永生化淋巴细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及永生化淋巴细胞的制备方法。

背景技术

永生化淋巴细胞经特异性抗原诱导后，可产生针对该抗原的特异性抗体或细胞因子。现有技术中，永生化淋巴细胞通过EB病毒感染、转染癌基因或端粒酶获得，制备方法繁琐，成功率低。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种永生化淋巴细胞的制备方法，方法简单易于操作，且成功率高。

实现本发明目的的技术方案：

一种永生化淋巴细胞的制备方法，其特征在于：免疫动物后，用动物白血病病毒感染同种动物脾脏产生的淋巴细胞，对前述感染白血病病毒的淋巴细胞进行培养，获得永生化淋巴细胞。

动物可以为小鼠、家兔、鸡、猫、牛、羊或猴。

优选一，感染白血病病毒的淋巴细胞可以通过如下方式获得：

步骤一：对动物进行特异抗原免疫；

步骤二：向动物腹腔注射同种动物白血病病毒；

步骤三：通过动物的脾脏获得感染白血病病毒的淋巴细胞。

步骤三中，通过如下方法获得淋巴细胞：

取脾，无菌研磨管中用淋巴细胞分离液将脾脏研磨，研磨后筛网过滤；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，覆盖培养基，离心；吸出淋巴细胞层，再加入培养基，离心收集细胞；倾倒上清液，用淋巴细胞培养基重悬细胞，细胞计数后，常规培养。

优选二，感染白血病病毒的淋巴细胞还可以通过如下方式获得：

步骤一：对动物进行特异抗原免疫；

步骤二：通过动物脾脏获得淋巴细胞；

步骤三：用同种动物白血病病毒感染步骤二获得的淋巴细胞。

步骤二中，通过如下方法获得淋巴细胞，

取脾，无菌研磨管中用淋巴细胞分离液将脾脏研磨，研磨后筛网过滤；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，覆盖培养基，离心；吸出淋巴细胞层，再加入培养基，离心收集细胞；倾倒上清液，用淋巴细胞培养基重悬细胞，细胞计数后，常规培养。

优选三，感染白血病病毒的淋巴细胞还可以通过如下方式获得：

步骤一：选取被白血病病毒自然感染的动物，取出该动物的脾脏；

步骤二：通过脾脏获得感染白血病病毒的淋巴细胞。

步骤二中，通过如下方法获得淋巴细胞：

取脾，无菌研磨管中用淋巴细胞分离液将脾脏研磨，研磨后筛网过滤；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，覆盖培养基，离心；吸出淋巴细胞层，再加入培养基，离心收集细胞；倾倒上清液，用淋巴细胞培养基重悬细胞，细胞计数后，常规培养。

本发明具有的有益效果：

本发明通过白血病病毒感染获得永生化淋巴细胞，白血病病毒可以将T淋巴细胞、B淋巴细胞都永生化，而EB病毒感染只能诱导B淋巴细胞永生化。自然感染情况下，白血病病毒可感染不同种属的动物，感染的宿主范围广，且诱导永生化的比率高，而EB病毒仅能感染人来源的细胞，且只能诱导B淋巴细胞永生化。本发明预先进行免疫诱导，可提高淋巴细胞的敏感性，促进淋巴细胞克隆的形成，极大的提高了病毒的感染率和淋巴细胞的反应性，大大提高了动物体内淋巴细胞和分离培养淋巴细胞永生化的概率。本发明方法简单易于操作，具有很高的成功率。

具体实施方式

可以用小鼠、家兔、鸡、猫、牛、羊或猴制备永生化淋巴细胞，本发明实施例均采用小鼠.

实施例一：

步骤一：对小鼠进行特异抗原免疫。

具体实施时：

选择四周龄BAL B/C小鼠，对小鼠进行免疫，根据抗原的特性不同，分为如下两种方案：

(1)可溶性抗原：免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫：抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8～1ml，0.2ml/点)

3周后，第二次免疫：剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml)

3周后，第三次免疫：剂量同一，不加佐剂，ip(5～7天后采血测其效价)

2～3周后，加强免疫；剂量50～500μg为宜，ip或iv(静脉内注射)

3天后，取脾。

(2)颗粒抗原：免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×10⁷个细胞。

初次免疫：1×10⁷/0.5ml ip