[发明专利]一种高山离子芥三价铁还原酶基因CbFRO及其编码产物的氨基酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种高山离子芥三价铁还原酶基因CbFRO及其编码产物的氨基酸序列。

背景技术

高山离子芥（Chorispora bungeana）是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、高盐碱、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海拔3600～3900m。年平均气温在-5～-7 ℃之间，6～8月平均气温为3.6 ℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、高盐碱、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。

铁是植物生长发育中必需的营养元素之一。但由于受土壤pH值的影响，铁在土壤中经常是以比较稳定的氧化物形态Fe（III）存在，其在水中的溶解度非常低，因此能为植物吸收利用的铁只占很小的比例。一般来说，植物生长所需要的最适铁浓度为10^-9~10^-4mol/L。但在碱性土壤（pH7.4~8.5）中，可溶性铁的浓度只有10^-10 mol/L (Guerinot 和Yi 1994)，因而植物表现出缺铁失绿症，给农业生产造成极大的损失。为了应对缺铁胁迫对植物自身生长的影响，高等植物在长期进化过程中逐渐形成了不同的适应性机制(Staiger 2002)。Romheld和Marschner(1986)在总结前人研究工作以及对120种来源不同植物缺铁反应机制的研究基础上，提出高等植物适应缺铁胁迫的铁素吸收机制I系统和机制II系统（Bughio，2002；Curie，2001），发现三价铁还原酶的研究对提高植物的生长、发育有重要的意义。

由于高山离子芥处于极端环境（高盐碱、低温、高辐射等），积累了适应极端胁迫的有益突变，所以克隆和研究高山离子芥三价铁还原酶基因CbFRO将会扩大三价铁还原酶基因资源，从而为利用高山离子芥的构建转基因植物提供了物质基础。

发明内容

本发明旨在从高山离子芥基因组中分离一种高山离子芥三价铁还原酶基因CbFRO，扩大三价铁还原酶基因资源，从而为利用高山离子芥的相关有益基因构建转基因植物提供了物质基础。

本发明的另一个目的在于提供一种高山离子芥三价铁还原酶。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明根据Genebank中公布的植物三价铁还原酶基因的序列设计兼并引物扩增CDS的保守区，得到目的片段。将目的片段回收后，连入生工pUCM-T载体。连接后的质粒转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取白斑提取质粒，经PCR验证为阳性克隆后测序。所述三价铁还原酶基因CbFRO具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列，基因全长975个碱基，包含一个680个碱基的开放阅读框。该三价铁还原酶基因CbFRO能够编码CbFRO蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由260个氨基酸组成。

测序结果在NCBI上比对，发现克隆得到的CbFRO的片段与拟南芥FRO同源性达到90%（图1）。

本发明对不同Fe浓度诱导CbFRO基因进行了鉴定。结果显示（图2），在缺铁（0μM）处理下会有很明显的增加，在处理12 h，表达量甚至增加到了对照的33倍；富铁（500μM）处理其表达量也增至对照的4.7倍；随时间的延长，两个浓度处理下CbFRO的表达都明显下降，当处理到36小时时，表达量又忽然增强，而且缺铁处理要明显高于富铁处理。实验结果表明，高山离子芥CbFRO基因在缺铁和富铁环境中都会发生高表达，说明CbFRO基因可以快速、强烈响应环境中铁离子浓度的变化，使植物及时适应变化的环境，因此，CbFRO基因与高山离子芥极端环境抗逆性，尤其是铁离子的缺乏或富集胁迫密切相关。

 

附图说明

图1  CbFRO基因同源性比对。

图2  不同铁浓度下，三价铁还原酶基因CbFRO表达差异。