[发明专利]人轮状病毒毒种ZTR-68毒株及其分离，培养与鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及轮状病毒，尤其是人轮状病毒毒种毒株的分离、鉴定及毒株的免疫学效果评价。 

背景技术

人轮状病毒（human rotavirus）是世界范围内引起婴幼儿腹泻最主要的病原体之一。在全球5岁以下的婴幼儿中，每年因轮状病毒感染导致的急性胃肠炎达1700万例，引起约4万名婴幼儿死亡，这些死亡病例中的80%发生在亚洲和非洲的低收入发展中国家。在我国，因腹泻住院的5岁以下的婴幼儿轮状病毒检测阳性率约为50%。轮状病毒感染在婴幼儿主要表现为突然发病、水样便、呕吐、发热和脱水，最终重症婴幼儿因严重脱水、电解质紊乱等导致死亡。目前尚没有治疗轮状病毒感染的特效药，多采用对症治疗，如静脉或口服补液，以纠正脱水和电解质紊乱。 

    灭活轮状病毒疫苗是一种安全有效地预防儿童因感染轮状病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有灭活轮状病毒疫苗产品上市。目前临床前研究或投放市场的轮状病毒疫苗均为口服减毒活疫苗，减毒活疫苗尽管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引发肠套叠和毒力回复突变及产生新的变异株的风险；以及冷链保存系统要求费用高，因此，研制安全、有效的灭活轮状病毒疫苗不仅在避免减毒活疫苗使用中存在的问题方面具有优势，也为未来研制联合疫苗提供基础。综上所述，研制灭活轮状病毒疫苗具有重要意义及应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源性轮状病毒野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性好；该毒种可应用于开发人用轮状病毒疫苗的生产毒种，适用包括减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗；并提供上述毒株的分离、鉴定方法以及免疫学效果评价。 

本发明公开了一种人轮状病毒毒种毒株ZTR-68于2011年09月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，编号：CGMCC  No.5265,建议分类命名轮状病毒Rotavirus A； 

本发明所涉及ZTR-68毒株的分离方法：

（1）获取病毒样本

收集医院儿科一腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01 M PBS，pH 7.2溶液中，12000 g离心20分钟取上清液，并使用0.22 μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；

（2）ZTR-68毒株病毒在MA104细胞上的适应

采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P 29 代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8% BCS重悬细胞，稀释至10^5.0细胞/ml，按2×10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200 μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用。

在本发明的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用12000×g离心20分钟取上清液，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，并采用不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。 

本发明所涉及ZTR-68毒株的培养方法： 

（1）ZTR-68毒株病毒在Vero细胞上的适应：

采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P 136代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1 ml，接种量约为10^4.0～10^5.5 CCID₅₀/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用；

（2）病毒毒株ZTR-68的克隆纯化：