[发明专利]人轮状病毒毒种ZTR-68毒株及其分离，培养与鉴定

权利要求书

1.一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于该毒株为轮状病毒（Rotavirus A）ZTR-68毒株，于2011年09月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：CGMCC No. 5265。

2.如权利要求1所述的人轮状病毒毒种ZTR-68毒株的分离方法，其特征在于具体如下：

（1）获取病毒样本

收集医院儿科一腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01 M PBS，pH 7.2溶液中，12000 g离心20分钟取上清液，并使用0.22 μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；

（2）ZTR-68毒株病毒在MA104细胞上的适应

采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P 29 代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8% BCS重悬细胞，稀释至10^5.0细胞/ml，按2×10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200 μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用。

3.如权利要求1所述的人轮状病毒毒种ZTR-68毒株的培养方法，其特征在于具体如下：

（1）ZTR-68毒株病毒在Vero细胞上的适应：

采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P 136代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1 ml，接种量约为10^4.0～10^5.5 CCID₅₀/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用；

（2）病毒毒株ZTR-68的克隆纯化：

在Vero细胞上已适应传代到第7代次的轮状病毒收获液，稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，接种于已形成单层的Vero细胞六孔培养板，37℃吸附2小时，加入不含小牛血清的DMEM维持液，48小时后去除培养液，加入含0.8%琼脂糖-DMEM，待琼脂固化后，反置培养于37℃，3天后于镜下观察蚀斑形成，用巴氏管吸取出蚀斑，置于1.5 ml离心管，加入0.5 ml DMEM维持液，漩涡振荡至均匀，随即接种于Vero细胞单层，37℃培养3～4天，待细胞病变后收获病毒，收获病毒继续接种于Vero细胞生长传代。

4.如权利要求1所述的人轮状病毒毒种ZTR-68毒株的鉴定方法，其特征在于具体如下：

（1）ZTR-68毒株病毒滴度测定：

取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒FFA滴定，按10^4.0细胞/100 μl/孔 加入MA104细胞，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度10个孔，37℃吸附2小时后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养16小时，采用50% 甲醛溶液4℃固定细胞板2小时，洗净甲醛，随后加入含1：500稀释由中国医学科学院医学生物学研究所制备的抗轮状病毒豚鼠血清的5%BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后加入含1：2000稀释的Millipore公司制造的羊抗豚鼠FITC抗体的5% BSA-PBS pH 7.2 溶液，37℃培养1小时，洗板后在荧光显微镜下判定结果，结果计算按Reed-Muench Method公式计算：                                                ，Log ID₅₀（FFA）= (log dilution above 50%) + (Proportionate distance × log dilution factor)；

（2）ZTR-68毒株病毒中和鉴别实验：

将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100 μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃ CO₂孵箱中和1小时后，按104细胞/100 μl/孔加入经消化悬浮的Vero细胞，37℃ CO₂孵箱中培养8～10天，观察结果；

（3）ZTR-68毒株病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建：

病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，并根据A组轮状病毒G1型基因型全基因序列设计合成针对11个RNA片段的11对引物，并分段以RT-PCR方法获得11个cDNA基因片段，克隆入pMD19-T载体中，逐一进行测序；

（4）不同代次ZTR-68毒株病毒基因组稳定性及序列比较：

病毒通过在Vero细胞传代培养，收获P1代次至P10代次的病毒收获液，病毒基因组的核酸提取按TAKARA MiniBEST 病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，非变性PAGE凝胶电泳11小时，硝酸银染显色后于凝胶成像仪记录图像，根据轮状病毒基因序列设计合成针对VP4基因和VP7基因的2对引物，病毒基因RNA逆转录使用TAKARA OneStep RT-PCR试剂盒，按操作手册进行，通过克隆测序后，使用MEGA软件对不同代次的病毒VP4和VP7基因序列进行比较，其基准序列使用本实验室对该分离毒株接种Vero传代至第2代所获取的基因，共比较1～10代病毒的VP4和VP7基因序列。