[发明专利]一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建含有SRF基因的重组真核表达质粒；

(2)诱导人间充质干细胞向Nestin⁺细胞分化：当步骤(1)中细胞至70-80％融合时，去除原有培养基，加入诱导培养基Ⅰ培养5～6小时；

所述步骤(2)中所述诱导培养基Ⅰ为含有5mmol/L β-巯基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；

(3)诱导Nestin⁺细胞向胰腺始祖细胞分化：在步骤(2)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基Ⅰ，加入诱导培养基Ⅱ培养7～8天；

步骤(3)中所述的诱导培养基Ⅱ为含有5～20nmol/L bFGF、5～20nmol/L EGF、2％B27、0.1％β-巯基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；

(4)诱导胰腺始祖细胞向胰岛素分泌细胞分化：在步骤(3)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基Ⅱ，加入诱导培养基Ⅲ，同时转染步骤(1)中的SRF基因的重组真核表达质粒，培养7～8天；

步骤(4)中所述的诱导培养基Ⅲ为含有5～20nmol/L Exendin-4、5～20mmol/L尼克酰胺、2％B27和2％胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中构建含有SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体为pEGFP、pcDNA3.1或pCMV。

3.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的人间充质干细胞包括羊水、骨髓、胎盘、脐带血或脂肪组织来源的间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的SRF真核表达质粒为去内毒素的质粒，质粒超螺旋带型清晰，A260/A280＝1.8～2.0。

5.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述的诱导培养基Ⅱ为含有10nmol/L bFGF、10nmol/L EGF、2％B27、0.1％β-巯基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。

6.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的诱导液培养基Ⅲ为含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2％B27和2％胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。