[发明专利]基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于一种检测单核苷酸多态性的生物传感方法，包括等位特异性连接酶链反应，通用PCR扩增反应，限制性内切酶消化反应以及利用液相色谱对目标基因型特异性的生物编码长度荧光标记核酸片段的多组分定量检测。

背景技术

基因多态性的检测在分子生物学、病原检测、临床检验、新药开发和人类的起源与进化方面的研究中具有非常重要的作用。人类的许多遗传疾病如α和β地中海贫血症等都是由于单基因突变产生的。这些遗传疾病是我国最主要的出生缺陷之一，严重影响我国的人口质量，给社会与家庭带来沉重的经济负担，因此，需要建立一种快速、灵敏、特异性的高通量检测技术。传统基因突变检测主要借助于电泳、质谱或基因芯片方法，这些方法需昂贵精密仪器，操作程序复杂，技术外延性差，分析周期长，故不适于进行大规模人群筛查与产前的生物学研究。目前国际上的主要趋势都集中于以DNA修饰酶为基础，利用酶催化反应提高基因突变鉴定方法的忠实性、可靠性与灵敏度，发展操作简便、快速可靠、低成本、高通量的基因突变分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特异性延伸或外切建立的TaqMan探针分析、单核苷酸延伸分析等，基于DNA连接酶的等位特异性连接建立的寡核苷酸连接分析、连接酶链分析等，基于DNA内切酶结构识别的Invader分析等。但是，这些检测方法大多基于核酸分子杂交、凝胶电泳分析，核酸链的多重标记，要么灵敏度不高、重现性不好、可靠性差，要么分析通量较低、成本较高，且需要精密的仪器，不能满足经济、准确、快速检测的需求。本发明建立的基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，样品用量少、操作简便、成本较低，且可进行多组分同时测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，这种方法样品用量少、操作简便、成本较低，且可进行多组分同时测定。

本发明的技术方案是，基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，包括以下步骤：

(1)等位特异性连接酶链反应；

(2)通用PCR扩增反应；

(3)限制性内切酶消化反应；

(4)基于液相色谱的核酸片段多组分定量检测。

以下对本发明做出进一步说明。

所述基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法采用以下步骤实现：

等位特异性连接酶链反应产生与目标基因型匹配的连接产物，经通用PCR扩增反应产生连接产物的荧光标记扩增产物，通过限制性内切酶消化反应将扩增产物转化为目标基因型特异性的长度编码荧光标记核酸片段，利用液相色谱实施核酸片段多组分定量检测。

本发明中，所述基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测分以下几个步骤实现：

等位特异性连接酶链反应：20μL 1×Taq ligase buffer反应缓冲溶液(20mM Tris-HCl，25mM KAC，10mM Mg(AC)2，and 10mM DTT，1mM NAD+，and 0.1％Triton X-100，pH 7.9)中包含10pM等位特异性区分探针对，1U/μL热稳定Taq DNA连接酶和一定浓度的相应目标链，于热循环仪中进行连接酶链反应。95℃变性3min，10个循环：95℃变性1min，60℃退火杂交连接5min。

通用PCR反应：连接酶链反应之后取10μL上述反应液，添加1μL dNTPs混合溶液(10mM)，0.5μL Vent exo-DNA聚合酶，12.5μL通用引物混合溶液(浓度分别为4μM)，5μL 10×Thermopol buffer(100mM KCl，200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，and 1％Trion-X-100，pH 8.8)，同时调整溶液反应体积到50μL，于PCR仪中进行PCR扩增反应。95℃变性3min，30个循环：95℃变性10s；70℃退火30s；72℃延伸反应15s，最后72℃延伸7min，4℃避光保存备用。

限制性内切酶反应：通用PCR反应之后取26μL上述反应液，添加1μL RsaI限制性内切酶，3μL 10×NEB buffer 4(200mM Tris-Ac，100mM Mg(AC)2，500mM KAC，and 10mM DT T，pH 7.9)，混匀，于37℃反应2h，然后65℃加热20min进行RsaI限制性内切酶的灭活处理，然后4℃避光保存备用。