[发明专利]人精氨酸酶和定点聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种精氨酸酶，以及其制备方法和在治疗与精氨酸酶相关的疾病中的应用。具体的，本发明提供了一种点突变的精氨酸酶及其制备方法和在治疗与精氨酸酶相关的疾病中的应用。本发明还提供了一种位点特异性聚乙二醇化的精氨酸酶及其制备方法和应用。

背景技术

精氨酸是一种哺乳动物包括人的重要氨基酸，参与各种生理过程，包括细胞增殖和生长。例如，精氨酸可作为潜在信号分子氧化氮(NO)合成的直接前体。NO作为一种精神递质，平滑肌松弛剂和血管扩张剂而起作用。NO的生物合成涉及由氧化氮合酶催化的Ca⁺⁺及NADPH-依赖性反应。精氨酸的另一个作用是作为多胺、亚精胺或精胺的前体，参与不同的生理过程。

有研究发现，精氨酸低于8μM水平时，癌细胞发生不可回复的细胞死亡(Srorr&Burton，1974，The effects of arginine deficiency on lymphoma cells.Br.J.Cancer 30，50)。通过研究对细胞生长的影响发现，将精氨酸移除后正常细胞系会由细胞周期的G0期进入静止状态，且能在这种环境下存活几周而无明显损伤；当精氨酸浓度恢复正常时，细胞又能开始恢复正常的生理周期；而对于肿瘤细胞来说，精氨酸的匮乏会导致其经过细胞周期G1期的‘R’点进入S期，并很快凋亡。这种由于精氨酸匮乏而导致肿瘤细胞的凋亡是不可逆的。因此，科学家们开始考虑通过控制机体中精氨酸的水平来对肿瘤，尤其是营养缺陷型肿瘤如肝癌和黑素瘤进行治疗。现今这种方式已被用来研究各种肿瘤细胞的抑制。

精氨酸酶是催化水解L-精氨酸生成鸟氨酸与尿素的反应的酶，一般含于产生尿素的动物(哺乳类、板鳃鱼类、两栖类、海龟类)的肝脏、肾脏、精巢中，作为尿素循环的一个环节而起作用。精氨酸酶是催化哺乳动物尿素循环途径中尿素形成最终步骤的酶，将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。在大多数哺乳动物中，人精氨酸酶家族包括精氨酸酶I和精氨酸酶II。精氨酸酶I主要在肝脏细胞表达，精胺酸酶II在肾脏和红细胞表达为主。

通过两种方法可以得到精氨酸酶，一是从产生它的生物体中分离出来，另一种是通过基因工程技术重组得到。通过基因工程技术重组生产精氨酸酶存在其优越性。例如，实验证明，大肠杆菌可以生产大量的精氨酸酶。然而，通过基因工程技术重组生产精氨酸酶有时会存在技术难题，例如，酶活性较低，或在体内的稳定性差及半衰期短，无法应用于实际临床。

US7951366B2公开了一种利用精氨酸剥夺来治疗人恶性肿瘤的药物组合物及方法。其中使用了带有his-tag的重组人精氨酸酶I，通过分子量为5,000(MW5,000)的聚乙二醇对精氨酸酶N-端或表面氨基酸中带有氨基的基团共价偶联聚乙二醇修饰，修饰后的人精氨酸酶的稳定性增加，在人血清中的半衰期为3天。

US20100247508A1中对带有his-tag的人精氨酸酶进行了改造，将168和303位半胱氨酸替换为丝氨酸，并利用分子量为20KDa的聚乙二醇对人精氨酸酶进行修饰。但是，与US7951366B2公开的重组人精氨酸酶I相同，该精氨酸酶带有额外的多肽片段如His-tag。而大部分国家的药物管理机构不建议使用这些多肽片段，例如中国国家食品药品监督管理局在“人用重组DNA制品质量控制技术指导原则”中提出以简化生产工艺为目的在产品中引入额外的多肽片段如His-tag，在最终产品中应尽可能去除。

WO 2011/008495A2公开了在保留人精氨酸酶本身所带有的三个半胱氨酸的基础上，在N端第三个氨基酸的位置加入了一个半胱氨酸残基，然后利用分子量为20KDa的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺对加入一个半胱氨酸残基的人精氨酸酶进行修饰。但该人精氨酸酶本身所带有的三个半胱氨酸仍然存在，形成的PEG化人精氨酸酶的产物不均一且产率低，难于分离纯化。

因此，本领域需要一种更好的精氨酸酶或其衍生物，用于治疗与精氨酸相关的疾病或异常。

发明内容