[发明专利]一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。

背景技术

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是制备羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂如他汀类药物的关键手性中间体。他汀类药物是目前世界上最为畅销的降胆固醇和降血脂药物，因此，作为他汀类药物关键手性中间体的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有较高的需求量和广泛的应用范围。

目前，利用还原法生产4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分为化学法和生物法，其中生物法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点被广泛地研究和应用。在生物法过程所选取的还原酶中，又以NAD依赖型和可以以异丙醇作为氢供体者为最佳。因为NAD较NADP廉价，而异丙醇相较于葡萄糖，氧化后不会产生酸性物质，且不易造成反应液乳化，有利于下一步的提取过程。在该过程反应体系的选择中，又以单一水相反应体系为较好。生产中大量使用有机溶剂，可能增加环境和安全风险。在单一水相反应体系获得较高的底物浓度，是目前该项研究中的热点。

中国发明专利申请例如申请号200810124754.2、201010213724.6、201110225388.1等公开了数种酮还原酶生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法采用的辅因子均为昂贵的NADP，并需要添加葡萄糖作为氢供体。其底物浓度虽然可以达到30％，但是必须添加大量有机溶剂形成两相体系，并且需要分批补料加入底物，操作繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂和氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，特别是，所述生物催化剂为酮还原酶KRED102，所述氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为5.0～9.0的水相缓冲液中进行，并且反应体系中添加有聚乙二醇400作为底物分散剂以及二价金属离子作为酶活力增强剂。

根据本发明的进一步实施方案：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度为1％～30％(w/v)，酮还原酶KRED102的浓度为0.01％～0.8％(w/v)，异丙醇的浓度为1％-20％，聚乙二醇400的浓度为10％～70％(v/v)，所述二价金属离子的浓度为10～500mM。其中：反应起始时的反应体系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的浓度优选为10％～20％(w/v)例如为16％(w/v)，酮还原酶KRED102的浓度优选为0.02％～0.1％(w/v)例如为0.04％(w/v)，异丙醇的浓度优选为5％～10％(v/v)例如为8％(v/v)，聚乙二醇400的浓度为40％～60％(v/v)例如为50％(v/v)，二价金属离子的浓度优选为0.5～2mM例如为1mM，二价金属离子可以以其无机盐例如盐酸盐、硫酸盐等形式引入到反应体系中。

所述的水相缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。

根据本发明的一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入水相缓冲溶液，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯，异丙醇，酮还原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二价金属离子的无机盐，于温度20℃～40℃下，搅拌反应，利用气相色谱监测反应的转化率，至转化率达到 80％～100％，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。其中，反应温度进一步优选为25℃～37℃。通过该实施过程获得的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品已经达到应用的要求，无需再进一步纯化。

优选地，所述的二价金属离子为钙离子或镁离子，含有所述二价金属离子的无机盐为氯化钙或氯化镁。

根据本发明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、酮还原酶KRED102、聚乙二醇400均可商购获得。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：