[发明专利]一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用基因芯片方法来检测黄病毒的方法。

背景技术

黄病毒属(Flavircls)是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。过去曾归类为虫媒病毒。在我国主要流行的黄病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革病毒。这类病毒结构相似，大多数是20面体立体对称的有包膜的RNA病毒。它们能在节肢动物(如蚊、蜱、白蛉等)体内增殖，对节肢动物不致病，但可以通过昆虫呵咬传染给脊椎动物或人，引起自然疫源性疾病。大多数的病毒引起人畜共患的、自然疫源性疾病，呈多种多样的临床表现，主要包括脑炎或脑脊髓炎以及全身性感染等。由于节肢动物既是储存宿主又是传播媒介，其分布受地理与气候的影响，故所致疾病具有明显的季节性和地域性。黄病毒科(Flaviviridae)包括3个病毒属，即黄病毒属(flavivirus)、瘟病毒属(pestivirus)和丙型肝炎病毒属(hepacivirus)，共有60多种病毒。

发明内容

针对黄病毒，本发明提供一种能够简单快速区分4种黄病毒的检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)制备黄病毒检测基因芯片；

(2)设计通用引物用于扩增多种黄病毒特异性基因片段；

(3)将扩增产物与基因芯片进行杂交；

(4)扩增完毕后将产物与芯片杂交，杂交后，进行免疫反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。

该方法包括：应用该方法检测黄病毒所需要的通用引物和与之配套的PCR反应条件。其中引物序列如下：

引物：

SEQ ID NO.1：5’AACATGATGGGNAAYAGAGAGAA

SEQ ID NO.2：5’GTGTCCCANCCNGCMGTYTCYGC。

核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：

核酸扩增程序为：

(1)95℃  10min

(2)95℃  30s

(3)55℃  20s

(4)72℃  30s

(5)回到第(2)步，重复35次

(6)72℃  2min

以及制备检测基因芯片所用的寡核苷酸探针：

黄热病病毒探针

SEQ ID NO.3：

5’TGTAATCAAGGACCTATCCACCAAAGAAGGGGGAGGAT

西尼罗病毒探针

SEQ ID NO.4：

5’AAACTGGGTTAACATCCTGCGTGAAGTTGGCACCCGGCCT

日本脑炎病毒探针

SEQ ID NO.5：

5’TTCAGGCGTCCAAAAGTTGGGATACATTCTCCGTGACATA

森林脑炎病毒探针

SEQ ID NO.6：

5’CTGGCACCTAAAAAATTGTCAACATTGGAAGGAGGCCTCT。

基因芯片的制备方法为将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5-10min，同时将0.2μL标记有地高辛基团的基因片段也点在每一张尼龙膜上，作为阳性对照，将双蒸水也点在每一张尼龙膜上，作为阴性对照。

3、杂交和杂交斑点的酶联免疫显色，按照地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书进行。

地高辛标记PCR产物和寡核苷酸探针杂交方法如下：

预杂交

预杂交液先预热到53℃，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于53℃预杂交30min。

PCR扩增产物的变性

DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。

地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交

把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。53℃杂交1hr，温和摇动。

杂交阳性斑点的酶联免疫显色

杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。

结果判读