[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产葡萄糖脱氢酶的方法，主要用到微生物发酵方面的流加补料技术。

背景技术

葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase，缩写GlcDH），是短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶NAD(P)⁺等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸。葡萄糖脱氢酶广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等方面，这些酶催化反应一般都需要辅酶NAD(P)H的参与，而这些辅酶价格昂贵，因此NAD(P)H的再生对于消减成本是非常必要的。美国施贵宝公司在利用白地霉脱氢酶不对称还原4-氯-3-羰基丁酸甲酯合成(s)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯的规模化生产中，有效地利用了葡萄糖脱氢酶进行辅酶NADP⁺-NADPH的循环，该反应的产率高达95%，产品为降胆固醇药物的手性原料。

现有技术中，葡萄糖脱氢酶主要从动物的肝脏提取，或者由芽孢杆菌发酵而来，来源受到限制。而国内葡萄糖脱氢酶都主要依靠进口。由于葡萄糖脱氢酶具有广泛的应用价值，市场需求量也日益增加，因此，开发一种廉价高效的葡萄糖脱氢酶的生产方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中葡萄糖脱氢酶的来源受到限制而难以满足市场需求的问题，提供一种利用基因工程菌发酵生产葡萄糖脱氢酶的方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种葡萄糖脱氢酶的生产方法，是先构建表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌并将其接种至初始培养基中进行发酵，发酵过程中通过流加补料技术向包含所述重组大肠杆菌的发酵液中添加补料培养基，当发酵参数达到设定阈值时，再向发酵液中添加诱导剂，并继续发酵一定时间至发酵结束，最后从发酵液的培养物中取得葡萄糖脱氢酶；其中，流加补料时，补料培养基的流加速度随着发酵时间的延长而梯度递增，至添加诱导剂后保持不变。

流加补料技术是发酵过程中用来提高菌体浓度的一种传统方法。这种方法能控制发酵时培养液中营养成分的浓度，因此在细胞生长或产物形成对底物浓度受限敏感的工艺过程中使用比较理想。

根据本发明，所述的发酵参数可以为发酵液的细胞光密度、发酵液中的溶氧或发酵液中的碳源总浓度等。

若未经特殊说明，本发明中所述的细胞光密度皆指的是OD₆₀₀值。OD₆₀₀是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。OD₆₀₀指的就是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率成反比。

本发明优选的一种生产方法，包括以下步骤：

（1）、准备阶段：构建基因工程菌，配制种子培养基、初始培养基和补料培养基；使基因工程菌在所述种子培养基中活化，然后将活化后得到的种子液接种到初始培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/初始培养基=1%~4%；所述基因工程菌为表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌；

（2）、发酵过程：本发明根据发酵进行的不同阶段，细胞对培养液中营养成分的消耗速度不同，将发酵过程分为六个阶段，并以培养液中的细胞光密度（OD₆₀₀）来划分这六个阶段，依次为第一阶段0~4、第二阶段4~8、第三阶段8~12、第四阶段12~16、第五阶段16~20和第六阶段OD₆₀₀＞20；