[发明专利]针对丙型肝炎病毒E1E2 复合体的抗体、HCV 颗粒的组合物和药物组合物

说明书

本申请为申请号为200480008734.9，申请日为2004年3月31日的同名申请的分案申请。

本发明涉及抗HCV的新构象(conformational)抗体以及更特别地涉及单克隆抗体。本发明还涉及易于(liable)被所述抗体识别的颗粒的组合物，以及涉及包含它们的药物组合物。本发明还涉及HCV有包膜的亚病毒颗粒或纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，以及制备它们的方法。

丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，并且可导致肝细胞癌。世界范围内约200百万人慢性感染HCV，这种疾病已经作为一种严重的全球健康问题显现出来。HCV是一种有包膜的RNA病毒，属于黄病毒科的肝炎病毒属。其基因组是9.6kb正极性单链RNA，具有作为内部核糖体进入位点起作用的5’非翻译区(UTR)，编码大约3,000个氨基酸的多蛋白(polyprotein)的单一可读框以及3′UTR(Bartenschlager等，2000)。这种多蛋白在翻译同时和之后通过宿主细胞肽酶切割产生包括核心蛋白及包膜糖蛋白E1和E2的结构蛋白，以及通过病毒蛋白酶产生非结构蛋白(NS)2-5B(Bartenschlager等，2000)。与相关的正链RNA病毒类似，通过负链RNA中间体的方式发生复制并且由NS蛋白催化，其形成质膜附着的复制酶复合体。

患者血浆样品中存在的HCV颗粒的水平低以及缺乏支持有效HCV复制或颗粒装配的细胞培养系统妨碍了表征与病毒体相关的糖蛋白。当前关于HCV包膜糖蛋白的知识是基于利用病毒或非病毒表达载体的细胞培养物瞬时表达试验。这些研究已经显示了E1和E2糖蛋白相互作用形成复合体(Dubuisson，2000中的综述)。存在非离子去污剂时，检测到两种形式的E1E2复合体：通过非共价相互作用稳定的E1E2异二聚体和异质的二硫键连接的聚集物，后者被认为代表错误折叠的复合体。以前，通过用合成肽或重组抗原免疫已经获得了包膜糖蛋白特异性抗体。然而，构象敏感性E2反应性单克隆抗体(mAb)(H2)-其识别被认为是HCV糖蛋白异二聚体的天然萌芽前(prebudding)形式的非共价连接的E1E2异二聚体-不与血清来源的HCV RNA阳性颗粒反应(Deleersnyder等，1997)。此外，WO 92/07001公开了通过用从感染的黑猩猩中提取的HCV颗粒制剂免疫小鼠而制备的抗体，然而这些抗体未曾在天然HCV颗粒(即，源自感染患者)上进行测试。此外，WO 00/05266公开了从感染患者B细胞制备的抗体，然而这些抗体是根据它们结合重组E2蛋白的能力选择的。因此，所有这些抗体的应用都有限，或者用于诊断目的，或者用于治疗或预防目的，因此它们是用非天然HCV或其部分生产或选择的，而且未显示出可与天然HCV颗粒相互作用。

缺乏含有足够量和浓度的天然有包膜的HCV颗粒的HCV制剂，是迄今为止无法获得易于识别天然HCV颗粒的抗体的原因之一。实际上，血浆样品中低水平的HCV颗粒使表征和显现观察这种病毒变得困难。先前已经显示了在感染的急性期从自然感染患者的血浆中回收的病毒在蔗糖中具有大约1.06g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。相比之下，体外复制后从细胞培养物中回收的HCV在蔗糖中具有1.12g/ml的浮力密度(Yoshikura等，1996)。最后，从慢性感染个体中回收的HCV在蔗糖中具有大约1.17g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。血清来源病毒的低密度归因于其结合血清低密度脂蛋白(Thomssen等，1992)。已经显示高密度病毒与抗原-抗体复合物中结合到病毒的抗体有关(Kanto等，1995)。尽管有这些数据，但是仍然没有表明这些不同HCV群的蛋白组成，以及是否低密度级分(＜1.0g/ml)含有包膜、RNA和核壳作为完整病毒体。

因此，本发明的一个目的是提供与天然HCV颗粒反应的抗体。

本发明的另一方面是提供天然HCV颗粒的组合物，其量和浓足以允许有效免疫抗体产生动物。

本发明的另一方面是提供缺乏感染性，易于用作药物组合物的活性物质的特定HCV组合物。

发明详述

本发明涉及能特异性结合天然HCV病毒包膜的构象抗体。

措辞“构象抗体”指识别具有由其分子环境所限定的三维结构的表位的抗体。