[发明专利]一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因。

背景技术

菊粉，又称菊糖，是一类天然果聚糖的混合物，它由果糖分子通过β-2,1糖苷键连接，聚合度从2-60，其终端为葡萄糖单位（ETTALI BIM et al. Appl Microbiol Biotechnol,1987,26: 13-20.）。它广泛存在于菊芋(Helianthus tuber osus)、牛蒡(Arctium) 、菊苣(Chicory intybus)等多种尚未开发利用的植物中（GoudaM K. Biological Sciences,2002,5(5): 589-593.）。

菊粉酶（Inulinase,EC3.2.1.7），学名β-2,1-D-果聚糖酶，又叫β-果聚糖酶，是一种能降解菊粉成果糖和低聚果糖的多糖水解酶。菊粉酶具有两种作用方式，一种为外切型，从非还原端逐个水解β-2,1糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖单位的果聚糖，最终生成果糖和葡萄糖；另一种为内切型，水解菊粉多糖链内部的β-2,1 糖苷键，产生降低了聚合度的低聚果糖。据不完全统计，产菊粉酶的丝状真菌有17属40余种，酵母菌有10属20余种，细菌有12属10余种（杨慧敏,贵州农业科学, 2004,32(3):83-84）。

外切菊粉酶可以菊芋作为原料发酵生产酒精，水解菊粉制备高果糖浆。高果糖浆（HFCS，High Fructose Corn Syrup），具有冷甜性，风味的不掩盖性，溶解度高，保健性好等特点，广泛应用于饮料，雪糕、冰淇淋，烘焙食品，罐头等食品中（张乐兴,广州食品工业科技,2003,19(1): 44-45）。以菊粉为原料，利用酸法和酶法皆可制备高果糖浆，酸法虽然产量高，成本低，但副产物多，色素重，分离精制困难。若利用菊粉酶制备果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖含量可达90%以上。

具有低温活性的外切菊粉酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，但是，目前所报导的外切菊粉酶多为中温或高温酶，具有低温（0–20℃）活性的外切菊粉酶非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5。 

本发明的再一目的是提供编码上述外切菊粉酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述外切菊粉酶Z2-5可得自鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）。Z2-5的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

外切菊粉酶Z2-5总共含501个氨基酸，其中N端22个氨基酸为其预测信号肽序列“MIKLKKYGVLMLLLGVFGTSLA”，成熟的外切菊粉酶Z2-5含479个氨基酸。

本发明通过PCR的方法分离克隆了外切菊粉酶Z2-5的编码基因Z2-5，其全长1506bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。经BLAST比对，该外切菊粉酶基因Z2-5编码的氨基酸序列与GenBank中Sphingobacterium spiritivorum ATCC 33300来源的潜在外切菊粉酶（ZP_03966816.1）具有最高的一致性，为55%；与确证活性的Bacillus subtilis来源外切菊粉酶(CAA29137.1)的一致性为47%。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体，优选为pEASY-E1-Z2-5。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的外切菊粉酶基因插入到质粒pEASY-E1上，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY-E1-Z2-5。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/ Z2-5。

本发明制备外切菊粉酶Z2-5的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶表达；

3）回收并纯化所表达的外切菊粉酶Z2-5。