[发明专利]Bt杀虫蛋白Cry1Ac-a的表达体系

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种人工合成的Bt杀虫蛋白Cry1Ac-a的表达体系，包括人工合成的Bt杀虫蛋白的基因，含有这种基因的表达载体和该基因表达的产物。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thur ingiens , Bt）杀虫晶体蛋白对农业上许多重要害虫都具有高特异的杀虫活性，但是对人、脊椎动物、植物都完全无害，在自然界中可以被完全降解，因此被广泛用于虫害防治。转Bt 作物的应用为害虫防治开辟了新途径，降低了化学杀虫剂的使用量。随着水稻转基因技术研发和转基因品种培育的开展，我国目前培育出了多个转Bt基因的水稻品种，这些品种在通过生物安全评价后将被环境释放而推广应用，以满足不断增长的粮食需求。

转Bt作物新品种在被大量应用于农业生产前，必须对其进行生物安全性评价，以确保转基因品种的使用安全和环境安全。转基因生物安全评价主要是对转入的异源蛋白释放后产生的影响进行评估，因此进行转基因生物安全评价就必须获得大量与转基因作物表达一致的蛋白。

Cry1Ac蛋白是Bt杀虫晶体蛋白中的一种，对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫具有特异性的高毒杀能力，是目前转基因水稻中普遍使用的的一种杀虫晶体蛋白。转入水稻的Cry1Ac蛋白通常经过修饰激活。蛋白质的生物活性表现出与其氨基酸序列的高度相关性，氨基酸序列决定蛋白质的高级结构，而高级结构是蛋白质生物活性的基础，氨基酸序列的微小差别可能导致生物活性的完全不同，因此，转Bt基因品种中的Cry1Ac蛋白与其在苏云金芽孢杆菌中原始的大小、结构和活性均有差别。

本发明之前，Cry1Ac蛋白的获得一直依赖于进口。进口的高纯Cry1Ac蛋白价格十分昂贵，而且也与转入水稻中的编码基因产生的杀虫蛋白有差异。而利用苏云金芽孢杆菌提取得到的蛋白与转入水稻的Cry1Ac蛋白存在结构上的差异，并且作为原毒素，不能在宿主体外表现出生物活性。使用酶切激活后又引入杂蛋白，因此不能够直接利用其进行科学的评价实验。由于杂蛋白的存在需要再次进行分离提纯才能保证蛋白纯度，操作繁琐复杂。除此之外，Bt毒蛋白占植物总可溶性蛋白中的比例很小，从转基因植物体中直接分离难度较大，很难从转基因作物中直接获得足够的该杀虫蛋白。普通的蛋白质原核表达体系由于存在密码子偏好性的问题，也难以得到Cry1Ac蛋白的高效表达。

本发明对Cry1Ac编码框和编码序列进行了改造和优化，使之能够在大肠杆菌中稳定表达得到Cry1Ac-a，Cry1Ac-a与转入水稻中的编码序列表达的杀虫蛋白在氨基酸序列和结构上保持一致。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工合成的Bt杀虫蛋白Cry1Ac-a的表达体系，包括人工合成的Bt杀虫蛋白的基因，含有这种基因的表达载体和该基因表达的产物，以克服上述技术缺陷，使得该蛋白在大肠杆菌中高表达，高效、低成本获得Cry1Ac-a蛋白。

本发明提供的人工合成的Bt杀虫蛋白的基因，是对Cry1Ac编码框和编码序列进行了改造和优化而获得，即对Cry1Ac蛋白编码框优化后再进行大肠杆菌密码子偏好优化，并在5’端和3’端分别引入与表达载体一致的NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，氨基酸序列末端加入终止密码子TAA而获得。该基因序列见序列表SEQ ID No.1，记为Cry1Ac-a。编码表达的 的Cry1Ac-a蛋白氨基酸序列与转入水稻的杀虫蛋白氨基酸序列一致，具有杀虫活性,氨基酸序列见序列表SEQ ID No.2。改造后的Cry1Ac-a蛋白由615个氨基酸组成，分子量为68.7KD，等电点为5.42。

本发明提供的上述基因的表达载体，是将化学合成的上述基因Cry1Ac-a 的DNA片段通过NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接到同样酶切pET43.1a载体上( pET43.1a质粒载体可由市售，本实验室保藏)而获得，记为pET43.1a-Bt。

同本发明还提供利用上述含该基因表达载体生产的重组Cry1Ac-a杀虫蛋白。其方法是将获得的重组载体转入表达宿主BL21菌株中，得到表达菌，记为BL21(pET43.1a-Bt），发酵重组表达菌株，加入IPTG诱导高效表达，即获得有活性的Cry1Ac-a杀虫蛋白。

综上，Cry1Ac-a蛋白的表达方法，其步骤可归纳如下：