[发明专利]一种基于PCR的SNP分型方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种通过PCR进行SNP分型的方法，还涉及一种基于PCR的SNP分型方法在油菜聚合育种的应用。该方法快速，简单，成本低，可以广泛应用于疾病诊断和作物育种等领域。

背景技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

理想的分子标记的要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP无疑是符合上述要求的最佳选择。

SNP即单核昔酸多态性标记，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插人/缺失等。SNP的位点极其丰富，几乎遍及整个基因组。据估计基因组中大约平均每1000bp就会出现一个SNP。SNP标记在人群或生物群体中一般只有两种等位型(allele)故亦称为双等位标记(bi-allelic marker)。这样在检测时只需一个“+/-”或“全或无”的方式而无需像检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量。

SNP标记分型的手段既有传统的手段如SSCP(single strand conformation polymorphism)和CAPs(Cleavage Amplification Polymorphisms)等，也有现在较快速的手段如MassARRAY质谱和TaqMan探针方法等，还有基于芯片的检测手段如DNA芯片技术已经开发出来并迅速被应用和趋于成熟。使用高密度的DNA芯片或微列阵可以同时对上万个SNP的分型。目前SNP已经广泛地应用于关联分析，基因精细定位和分子标记辅助育种过程中。但是上述方法都存在一定的缺点：SSCP手段只能用非变性胶，实验条件苛刻，需要常温条件，一般实验室难以达到；CAPs手段实验过程繁琐，一个实验程序需要耗费很长的时间；MassARRAY质谱和TaqMan探针方法及其他芯片方法费用相当高昂，一般实验室难以承担。

本发明基于以上的考虑，实现一种既低廉，简单，又效率高的SNP分型方法，通过设计引物时，在正向引物的3’端引入特定的错配类型和错配位点，使引物对在含某一种SNP基因型的材料中PCR扩增的效率很高，而在另一种SNP位点的材料中PCR扩增的效率很低，从而达到SNP分型的目的。本发明是在与SSR分子标记一样的实验步骤条件下，很大地提高了引物多态性的比率，很大地扩大了覆盖基因组的区域。SSR分子标记在两个材料间多态性比例一般在30％左右，而本发明的分子标记方法在两个材料间多态性比例可以达到90％以上。在与SSR分子标记一样实验成本的前提下，本发明的分子标记方法有更高的效率。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种基于PCR的SNP分型方法，通过设计引物时，在正向引物的3’端引入特定的错配类型和错配位点，使引物对在含某一种SNP基因型的材料中PCR扩增的效率很高，而在另一种SNP位点的材料中PCR扩增的效率很低，从而达到SNP分型的目的。与许多现行的方法相比，其主要优点为快速，简单，成本低，可以广泛应用于疾病诊断和作物育种等领域。