[发明专利]基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法

说明书

 

一、技术领域    

本发明涉及一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，属于分子生物技术领域，具体涉及玉米半粒种子DNA快速提取，提取后的DNA适用于PCR扩增。

二、背景技术    

目前，植物DNA 提取已经发展了很多方法，可以从植物叶片、果实和种子等组织器官中提取DNA，但大多数方法提取时间较长，这些方法大多应用于科学研究，难以应用于快速检测领域。在提取植物DNA的过程中，需要根据植物组织材料的外在性质(来源、部位、形态等)和内在特点(化学成分、组织结构等)的差异，选择适宜的方法或作一些特殊的处理。

传统的DNA提取方法(SDS法和CTAB法)是在裂解细胞的基础上，用等体积的酚氯仿或酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，核酸留在水相，从而达到分离核酸的目的；加入RNA酶可以去除RNA；然后加入异丙醇或乙醇沉淀DNA；用70%乙醇漂洗沉淀，去除残留的有机溶剂和盐离子，以免影响DNA溶解和后续实验，最后用TE或ddH₂O溶解DNA备用。自从SDS法和CTAB法报道以来，国内外很多学者对这两种方法作了许多改进。经典的DNA提取方法不需要昂贵的仪器和药品，提取的DNA能够满足一般分子生物学研究的需要，已成为分子生物学实验室提取DNA最常用的方法。但这些方法也存在着很多不足，如操作步骤复杂、耗时长、易交叉污染、苯酚和氯仿等有机溶剂易造成环境污染并且有损操作者健康等。今后，DNA提取方法研究的发展方向：①用无毒的有机溶剂或无机溶剂代替有毒的有机溶剂；②简化操作步骤，朝着批量提取的方向发展；③提取过程朝着自动化方向发展，将DNA提取与其他分子生物学技术(毛细管电泳、基因芯片技术等)相结合，实现从样品处理到分析的过程全部自动化。

由于目前的DNA提取方法提取时间较长，在短时间内不能进行基于PCR的大量样品的检测，难以在基于PCR的快速检测中应用。为了突破DNA提取时间较长这个瓶颈，国内外很多研究者加入了DNA提取研究的行列，并取得了一些成绩。近年来有很多DNA快速提取方法的报道，提取时间缩短了很多，少数方法可以用于快速检测，但提取速度还不是很快，有待进一步加快。 

三、发明内容    

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法。

一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取技术，是先将玉米种子沿胚纵切，取含有胚的半粒种子放入1.5mL离心管中，再加入200μL～1000μL 提取液，所述的提取液为0.03M～0.2M氢氧化钾（ KOH）或氢氧化钠（NaOH）溶液，提取时间1min～48h，混匀提取液，混匀后的提取液即为DNA样品，用于PCR扩增。用于PCR扩增时DNA模板量为0.5μL～5μL，综合考虑DNA样品中杂质含量和加样的操作方便性，通常优先选择2μL作为DNA模板。

本发明提取过程简便，不研磨、不离心、不转管、不使用有毒试剂，最主要的是提取速度非常快。用SSR引物对该方法提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物用9%PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)检测，结果显示PCR扩增产物良好。

四、附图说明 

图1  提取液浓度和体积对PCR扩增产物的影响(材料：郑单958)

由图1可知，PCR扩增产物主要受提取液浓度影响，提取液体积200μL～1000μL的样品间差异不显著。提取液浓度0.01～0.02M的样品有较弱的目标带，0.03～0.05M的样品有中等亮度的目标带，0.06～0.2M的样品有清晰的目标带，0.3M的样品无目标带。

图2  提取时间对PCR扩增产物的影响

由图2可知，提取1min～48h的样品间差异不显著，提取3d的样品目标带亮度开始减弱，提取4d的样品目标带已经很弱。

图3  DNA模板量对PCR扩增产物的影响

由图3可知，各处理间差异不显著，说明该方法有很宽的DNA模板量适应范围。

图4  不同公司的Mix对PCR扩增产物的影响(材料：郑单958)