[发明专利]一种增加读长的测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种增加读长的测序方法。

背景技术

新一代测序技术(next-generation sequencing，NGS)主要包括焦磷酸测序法(sequencing by pyrosequencing)，合成法测序(sequencing by synthesis，SBS)和连接法测序(sequencing by ligation，SBL)。其中，连接法测序具有准确率高，成本低的优点，适用于转录本及比较基因组学研究，特别是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)的检测。

现有的一种连接测序法是基于在特定位置带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，分为h(h≤n)组，同一组寡核苷酸探针的不同荧光标记对应同一特定位置的不同碱基序列，不同组之间的区别在于：不同荧光标记对应的特定位置不同，因为该寡核苷酸探针的3’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接。每次连接反应，用于锚定的引物anchor通过互补配对结合于待测核酸片段的接头序列上，然后在T4连接酶的作用下，每个anchor后连接一个寡核苷酸探针，测得相应位置的碱基序列；一次连接之后将之前的anchor及寡核苷酸探针洗脱，重连anchor及更换另一组寡核苷酸探针进行连接，检测该组寡核苷酸探针对应位置的碱基；重复连接-检测-洗脱-连接的步骤，即可测得待测核酸片段接头序列的3’末端后第1、2......、h位的碱基序列信息。

此外，在上述连接测序法中，若将寡核苷酸探针的3’端活化并在其后继续连接片段时经常无法得到连接产物或得到的连接产物很少。通过实验研究，我们发现这是由于连接酶的保真度会随着与连接点的距离增大而降低导致，因此在上述连接测序法中读长h是受限的。不同的连接酶的保真度是不同的。以T4连接酶为例，经过验证，我们发现T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对，也即高质量的读长h≤6，读长过短。从第7位碱基开始，T4连接酶无法保证寡核苷酸探针与待测核酸片段之间碱基的正确匹配，因此寡核苷酸探针连接到anchor上时，第6位之后的碱基会产生错配。若经过处理，直接将寡核苷酸探针的荧光信号淬灭且活化其3’端，而在其后继续连接新的寡核苷酸探针，用以读取新的核苷酸序列信息，则只有碱基正确配对的寡核苷酸探针后面才能连接，而有错配存在的寡核苷酸探针后面无法连接。相比第一次连接上的寡核苷酸探针，此时连接上的新的寡核苷酸探针数量急剧下降，检测得到的荧光信号极其微弱，导致核苷酸的读取准确率降低。

因此，迫切需要一种新的连接测序法，能够增加读长，同时还能保证增加的核苷酸序列信息的读取准确率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加读长的测序方法，旨在解决现有技术中连接测序法读长过短的问题，并能进一步避免增加读长时出现核苷酸序列信息读取准确率低的问题。

为了实现发明目的，所述增加读长的测序方法包括以下步骤：

A.将第一anchor结合于待测核酸片段的接头上，该第一anchor带有酶切识别位点；

B.在第一anchor延伸末端连接荧光探针，检测其荧光信号，更换荧光探针并重复连接和检测操作，得到延伸末端后M个核苷酸序列信息；

C.利用酶切识别位点，以切刻内切酶进行酶切，得到在第一anchor延伸末端后保留N个核苷酸的酶切产物；

D.将酶切产物与荧光探针连接，检测其荧光信号，更换荧光探针并重复连接和检测操作，得到第M+1至N+K位的核苷酸序列信息。

其中，所述第一anchor上带有至少一个dU碱基。

其中，所述第一anchor的一端是封闭的。

其中，所述步骤C包括以下步骤：

C1.将荧光探针与第一anchor洗脱，锚定第二anchor并在其延伸末端连接自由探针，得到自由探针复合物；

C2.利用自由探针复合物所带酶切识别位点，以切刻内切酶酶切，得到在第一anchor延伸末端后保留N个核苷酸的酶切产物。

步骤C也可以通过以下方式实现：直接利用切刻内切酶识别第一anchor所带的酶切识别位点，并在第一anchor延伸末端方向进行酶切，将荧光探针中带有荧光标记的片段部分切掉，保留N个核苷酸，从而得到在第一anchor延伸末端后保留N个核苷酸的酶切产物。