[发明专利]鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽类及其制品安全检验领域的FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列，具体是一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙门氏菌致病的常见血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热；对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，该菌形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。该菌的检测主要依靠传统培养方法(参见国标GB/T4789.4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，虽然结果可靠，但操作复杂，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情蔓延。之后，许多研究学者建立了如荧光抗体技术、免疫磁珠富集法、ELLSA、自动酶联免疫荧光法、免疫组化、显色培养基法、DNA探针技术等检测技术，但在实践中都有不同程度的局限性。FQ-PCR技术具有快速、简便、灵敏等优点，并且由于该法采用引物和探针的“双保险”，因而特异性更强。该技术逐步应用于沙门氏菌的检疫后，对沙门氏菌病诊断和防治工作起到了积极作用，曾先后有学者以沙门氏菌stn、fimY、invA等为靶基因，建立检测沙门氏菌的FQ-PCR方法。但是只针对鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法极少，并且由于检测靶位点的特异性不强，以及假阳性的出现，可对检测结果产生影响，产生判断困难。

经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法、核酸及引物对有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法

本发明是通过以下的技术方案具体实现的。

利用荧光定量PCR仪检测荧光素的特点，将根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的探针标记为FAM荧光报告基团，经反复试验，优化FQ-PCR反应体系和反应参数，建立了鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO：1设计引物对和探针；所述引物对和探针具体为：上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物序列如SEQ ID NO：3所示，探针序列如SEQ ID NO：4所示。

步骤二，提取样品DNA

步骤三，FQ-PCR检测，其检测体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，5μM探针0.5μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；扩增参数具体为：95℃预变性5min后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；共45个循环(采用三步法，并在退火延伸阶段收集荧光信号)；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。

步骤四，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：通过FQ-PCR仪(BIO-RAD定量PCR仪)自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，检测成本低；并可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具有实用性；本发明检测的靶点具有单一特异性，提供的引物对和探针对不含目的基因的样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。本发明提供的引物对和探针检测DNA和菌液灵敏度分别可达2.5copies/μL和5cfu/μL，说明其具有良好的敏感性。

附图说明

图1为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法特异性评价试验扩增曲线图；

图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法DNA敏感性评价试验扩增曲线图；