[发明专利]检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测芜菁花叶病毒的一步多重RT-PCR法及其专用引物。

背景技术

芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，病毒粒子呈弯曲线形，长约720nm，宽约15-20nm，由95％的外壳蛋白和5％的RNA构成。病毒核酸为单链正义RNA，约由10,000个核苷酸组成。TuMV寄主范围广泛，在人工接种条件下，可侵染43科156属，超过318种双子叶植物及部分单子叶植物；主要侵染十字花科蔬菜作物和观赏性物种，是仅次于黄瓜花叶病毒(CMV)浸染大田蔬菜最重要的病毒。据调查，我国白菜因TuMV危害平均每年造成5％的产量损失，有些年份减产10％以上，病害严重的地块几乎绝收。对该病毒的快速、准确检测有助于控制其传播流行，减轻危害和损失。

常用的植物病毒检测方法有传统的生物学检测方法、血清学方法、电镜检测法和分子生物学方法等。传统生物学方法简单、直观、可靠，能准确反映病毒的生物学特性，但需要具备指示植物、温室、网室等隔离条件，且检测速度很慢，如隔离措施不当，容易交叉感染，影响准确性。电镜检测是最直接、最准确的检测病毒的手段，但用电镜观察时需要样品含有的病毒浓度较高，因此需要对被检病毒进行提纯，病毒提纯费时费力，且电镜法所需电镜及超速离心设备价格昂贵，操作对初学者掌握难度较大。血清学方法是检测植物病毒最常用的有效方法之一，该方法需要与被检病毒相对应的特异性抗血清。但抗血清制备需要的时间较长，且检测结果容易受抗血清的特异性影响，有时会有交叉反应。分子生物学方法是从核酸水平来检测病毒的存在，比血清学方法灵敏度高，可检测到皮克(pg)级甚至飞克(fg)级，并且特异性更强，可进行大批量样本的检测。由于分子生物学方法显著的优越性，使得其在病毒检测中得以迅速广泛的应用。

分子生物学方法包括核酸杂交、双链RNA电泳、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光定量PCR、芯片检测等方法，其中RT-PCR方法检测病毒是最为广泛应用的方法之一，该方法需要病毒基因特异性引物(GSP)对病毒核酸模板进行扩增检测。虽然ELISA技术已经广泛应用于植物病毒的检测，但其检测的灵敏性无法与RT-PCR方法相比，RT-PCR方法是DAS-ELISA方法敏感度的1000倍。随着人们对不同来源的病毒进行基因组测序工作的进展，GenBank的数据不断丰富，使得利用RT-PCR方法检测病毒变得更加切实可行。在此基础上人们进而开发了多重RT-PCR，在同一反应体系中同时检测多种病毒。一般RT-PCR检测法需要分两步进行：先提取样品总RNA，然后经反转录获得cDNA后进行PCR检测，步骤相对繁琐。在两步法的基础上人们为了简化步骤，开发了一步RT-PCR法，即反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行。

因此，建立快速、高灵敏度的病毒检测体系是对TuMV病毒防治的先决条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测芜菁花叶病毒的引物组。

本发明提供的检测芜菁花叶病毒的引物组，为如下引物组C、引物组A或引物组B：

所述引物组C包括引物对a和引物对b；

所述引物组A包括引物对a；

所述引物组B包括引物对b；

所述引物对a由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成；

所述引物对b由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子组成。

上述引物组中，所述引物组C还包括随机引物和Oligo d(T)18；

所述引物组A还包括随机引物和/或Oligo d(T)18；

所述引物组B还包括随机引物和/或Oligo d(T)18。

所述随机引物为Random Primer，购自TaKaRa公司，产品目录号为D3801；

所述Oligo d(T)18为Oligo d(T)18，购自TaKaRa公司，产品目录号为D511。

上述引物组中，所述引物组C由所述引物对a、所述引物对b、所述随机引物和所述Oligo d(T)18组成；

上述引物组中，所述引物组A由所述引物对a、所述随机引物和/或所述Oligod(T)18组成；

上述引物组中，所述引物组B由所述引物对b、所述随机引物和/或所述Oligod(T)18组成。