[发明专利]一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C。

2.一种人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系，所述细胞系通过将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于权利要求1所述的细胞系而得。

3.根据权利要求1或2所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系能够形成肿瘤。

4.根据权利要求3所述的细胞系，其特征在于，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。

5.根据权利要求4所述的细胞系，其特征在于，所述肿瘤能够发生转移，优选地，所述肿瘤能够转移到肝脏。

6.根据权利要求1所述的细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)分离原代结肠癌干细胞：取结肠癌组织剪碎后，消化获得单细胞悬液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗和小鼠抗人CD44 FITC单抗孵育；再用无菌流式细胞分选技术分离出原代结肠癌细胞；

2)原代结肠癌干细胞的体外培养：稀释步骤1)获得的原代细胞，接种于96孔板中进行培养；

3)结肠癌干细胞的培养及鉴定：当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，离心去上清，再将其消化后，以1∶5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中，筛选体内成瘤能力和体外克隆形成能力的P6C细胞；

4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系P6C，即得。

7.根据权利要求6所述的细胞系的制备方法，其特征在于，还包括将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于步骤4)获得的肿瘤干细胞系。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系或权利要求6或7所述的方法制得的细胞系在制备用于肿瘤形成或转移肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系或权利要求6或7所述的方法制得的细胞系在制备筛选抗肿瘤发生、肿瘤生长或肿瘤转移的药物中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。