[发明专利]一种建立双启动子甲醇酵母高效表达重组人金属硫蛋白系统的方法及该蛋白的制备纯化

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立嵌入甲醇应答元件及金属应答元件的双启动子甲醇酵母高效表达基因重组人金属硫蛋白(rhMT)系统的方法，以及利用该系统表达、制备、纯化该目的蛋白-金属硫蛋白的技术，属于生物制药领域，其关键是将一种含甲醇应答元件AOX，以及含或不含金属应答元件MRE的外源金属硫蛋白基因的载体质粒pPICZα-MT，通过磷酸钙转染(transformation)、电击转染或同源重组(double crossover recombination)等方式，将该含双启动子的外源基因引入相关宿主酵母细胞，其目的是提供一种适合工业化大规模低成本生产人金属硫蛋白的可行性实施方案。 

背景技术

1957年，美国科学家Margoshes在研究金属在生物学上的作用时，从马肾中首次发现I-型与II-型镉金属硫蛋白(Margoshes M.，Vallee B.L.A cadmium protein from equine kidney cortex.J.Ame.Chem.Soc.79：4813-4814(1957))。金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸基团，对多种重金属有高度亲和性，在一定的酸碱度(pH值)及细胞氧化-还原电位环境(可藉细胞器某处谷胱甘肽有还原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例显示)条件下易与多个镉、锌等金属离子结合的多肽蛋白质。哺乳动物的金属硫蛋白由约61个氨基酸组成，含有20个半胱氨酸和7个金属离子。金属硫蛋白作为一种应 激蛋白、抗自由基氧化剂、细胞锌离子介导剂等，具有提高人体免疫力、抵抗重金属中毒、参与微量元素的贮存、运输和代谢、排铅补锌、抗辐射、延缓衰老、保护人体心肺各器官等多种独特有效的生物学功能。 

可是迄今为止普遍缺少一种高效表达分泌基因重组哺乳动物尤其是人源金属硫蛋白或其类似物的制药工业可行的生产制备及纯化方法。复旦大学在专利CN01131966.6上公开了一种金属硫蛋白的制备方法，但属于猴而非人金属硫蛋白，且需要柱上凝血酶切除用于亲和层析的谷胱甘肽GST片断，成本太高，不具工业生产价值；北京大学在专利CN96100897.0上公开了一种酿酒酵母金属硫蛋白产生菌的选育发酵与提取工艺，用铜盐诱导制备Cu-MT；暨南大学在专利CN201110028345.4上公开了一种用IPTG诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽CBD-intrin1-MT的表达方法，很好地利用了intrin1片断的自剪切功能；但这两个专利涉及非人金属硫蛋白；暨南大学在专利CN200610112960.2上公开了生产利用小分子泛素相关修饰因子成熟肽(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)进行融合表达生产人I型金属硫蛋白hMT-I的方法，使该融合片断可被泛素相关修饰因子蛋白酶1(Ubiquitin-like protease 1)在原核生物体内水解，以释放可溶性hMT-I，但属于在原核生物中使用昂贵的IPTG诱导下表达，故将此述目的蛋白用于医药时存在细菌内毒素污染风险；另有专利CN200910246446.1一种将人金属硫蛋白接到人表皮生长因子的C端的生产人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白的方法，仅用于制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用和在制备皮肤护理药物中的应用，不具有普遍性；美国专利US5824512描述了一种表达Mal-MT融合蛋白的表达，其用途仅为环保废物处理。综上所述，一种普遍适合医药用大规模工业化低成本的表达、制备、纯化、检测人金属硫蛋白的产业化技术迫切 需要开发，尤其考虑到人源金属硫蛋白hMT-3在治疗神经退行性疾病上的广阔前景。hMT-3主要分布于中枢神经系统的星性胶质细胞，集中存在于细胞体和突起中，其次存在于神经元细胞中。通过鼠刺伤模型和缺血模型的研究发现，hMT-3参与中枢神经系统损伤修复。帕金森病(PD)的一种机理是由于6一羟基多巴胺等因子诱导自由基而产生的，而脑中某些金属硫蛋白异构体尤其是hMT-3的诱导剂，如氧化压力、细胞因子和炎症过程等能防止这种神经毒害，这与金属硫蛋白清除自由基有关。