[发明专利]一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法。

背景技术

血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是一类微血管血栓-出血综合症，主要是由于微循环中形成了血小板血栓，血小板数因大量消耗而减少所形成的紫癜。该病典型临床表现为五联征：发热、微血管病性溶血性贫血、血小板减少、中枢神经系统损害和肾脏受累。由于小动脉与微血管的栓死，导致器官缺血性功能障碍乃至梗死，对微循环依赖性强的器官(脑、肾等)也易出现症状。由于TTP起病急，患者一旦出现症状需要及时进行血浆置换，若患者未及时进行血浆置换或输注等有效的治疗，病死率可达90％以上，TTP缓解后复发率为30％～60％。

临床研究表明，在TTP的发病进程中，金属蛋白酶ADAMTS13与底物VWF因子扮演着极为重要的角色。VWF基因，Gene Bank ID：7450，位于第12对常染色体的短臂末端12p13.3，基因全长约180kb，有52个外显子和51个内含子。外显子大小差别很大，从40个碱基到1379个碱基(外显子28)。外显子28特别大，编码VWF中全部A1和A2同源区。VWF cDNA 5’区启动子前有250核苷酸的非翻译区，1-2289位碱基编码763个氨基酸的前-原肽，从2290碱基开始编码血浆中存在的成熟VWF。成熟VWF单体相对分子量为250×10³道尔顿，共包含有2050个氨基酸，在血浆中以多聚体的形式存在，是一个具有多功能域的大分子糖蛋白，具有高凝血活性。在VWF的A2区包含了金属蛋白酶ADAMTS13的酶切位点(Y1605-M1606)，在正常机体中，血浆中的ADAMTS13会将VWF多聚体裂解为粘附活性较低的小分子量多聚体，由于有ADAMTS13酶解VWF，从而使VWF分子大小处于动态的生理平衡状态。然而如果由于ADAMTS13酶基因的变异或存在针对抑制ADAMTS13酶活性的抗体，使机体内ADAMTS13活性出现先天性或获得性缺陷，ADAMTS13酶活性下降，导致超大分子量VWF的出现，而超大分子量VWF可在正常血流情况下网罗血小板，引起血小板自发性聚集，在全身微血管部位形成富含血小板血栓，VWF多聚体越大，网罗血小板的能力越强，形成血栓的能力也就越大，就会从而造成TTP的发生。因此快速检测ADAMTS13酶活性对于临床预防和治疗TTP起着极其重要的作用。

目前为止，已有多种检测ADAMTS13酶活性的方法，主要归结为两类：第一类为流体动态条件下的检测方法，如mini-vortex涡流所产生的高剪切率条件下的检测方法。第二类为静态条件下检测，包括：尿素或盐酸胍变性条件下酶解全长VWF底物检测方法；各种带GST或His尾巴的VWFA2区短肽作为底物检测方法，如GST-VWF115-His、GST-VWF73-His等；荧光标记VWF73检测方法等。其中荧光标记VWF73检测方法由于具有实时、快速、高通量的特点，已在欧美国家临床普及化。

目前已有两种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，其原理各不同。一种是由日本人Kokame于2005年建立，基于不同荧光基团之间的供体-受体(donor-acceptor)法，另外一种是由美国人John Owen于2006年建立，基于相同荧光基团之间的自猝灭(self-quenching)法，但这两种方法都是基于VWF73片段。VWF73片段是Kokame等人发现的ADAMTS13酶在体外的最小底物片段，位于VWF的A2区域，包括D1596至R1668的73个氨基酸，VWF73片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

Kokame建立的供体-受体法荧光底物由化学合成，其修饰位点选为VWF蛋白的Q1599与N1611，其原理是在VWF蛋白Q1599位点引入一供体荧光基团Nma，在N1611位点引入一受体荧光基团Dnp，当一定波长激光照射该荧光底物时，在Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量被临近的N1611位受体荧光基团Dnp所吸收。而当该荧光底物被ADAMTS13所酶解后，Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量无法被临近的N1611位受体荧光基团Dnp所吸收，从而导致Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量得以在检测仪器上测出。然而由于该法荧光底物是化学合成，成本高。同时由于该底物需类似DMSO之类的有机溶剂溶解，往往溶解不完全，从而影响检测结果的准确性。