[发明专利]珙桐PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对珙桐生物资源进行PCR鉴定用引物及使用该引物的PCR鉴定方法。

背景技术

珙桐属珙桐科珙桐属，为落叶乔木，花奇色美，是1000万年前新生代第三纪留下的孑遗植物，在第四纪冰川时期，大部分地区的珙桐相继灭绝，只有在我国南方的一些地区幸存下来，成为了植物界今天的“活化石”。为我国独有的珍稀名贵观赏植物，为世界著名的珍贵观赏树，常植于池畔、溪旁及疗养所、宾馆、展览馆附近，并有和平的象征意义，属于被子植物。材质沉重，是建筑的上等用材，可制作家具和作雕刻材料。是世界上濒于灭绝的、非常珍贵的、我国独有的单型属植物。由于它具有极高的观赏价值以及非常罕见等特点，被我国列为国家一级重点保护树种。为防止我国珙桐种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难以估量的损失，应该加大对我国珙桐资源的保护工作。

随着现代生物技术的出现，致使基因资源更多的是以非活体的遗传物质形式携带出境，增加了口岸查验的困难，为防止我国珙桐资源流失，建立有效的植物遗传资源出境检验鉴定方法就显得极为必要。目前国内外对珙桐检测识别仅限于形态上，在种的水平上未见有关其分子检测方法的研究。

为了保护我国珙桐种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断的珙桐遗传资源进行辨别，且应该适合口岸检查应用，简单且精确的生物鉴定方法，以此防止珙桐不会以非活体遗传物质形式等非传统形态被携带出国境。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珙桐的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的珙桐进行简单且精确的鉴定。

本发明应用衍生性酶切扩增多态性序列(dCAPS，derived cleaved amplified polymorphic sequences)分子标记方法对珙桐的分子检测方法进行研究，通过生物信息学的方法，在对珙桐与其近缘种植物叶绿体atpF-atpH基因序列进行分析和比较的基础上，设计dCAPS分子标记，建立了对珙桐稳定、高效的鉴定方法，可根据对扩增产物酶切结果的琼脂糖电泳判定是否有珙桐核酸存在。

dCAPS是一种通过等位基因快速检测、鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的分子标记方法。dCAPS技术原理为：在引物中引入错配碱基，使扩增的产物在一个生物型中具有相应的核酸内切酶酶切位点，而在另一种生物型中没有，PCR产物经过核酸内切酶酶切，通过分析图谱，进而检测出SNP位点。在本发明提供的用于鉴定珙桐的引物中，基于atpF-atpH基因中的一个SNP位点，利用dCAPS Finder2.0软件设计上游引物，用Primer Premier 5.0软件设计下游引物。

本发明提供珙桐PCR鉴定用引物，能对珙桐的DNA进行扩增，生成珙桐特异性扩增片段。

本发明提供的珙桐PCR鉴定用引物，其核苷酸序列为：

正向：5’-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3’

反向：5’-ATTTTATTGCCTTGGATG-3’。

本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得。

本发明提供了上述引物在鉴定珙桐种质资源中的应用。

本发明提供了一种珙桐PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，上述引物进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶进行酶切，反应结束根据琼脂糖凝胶电泳，若酶切产物为279bp大小，判定为阳性结果。

本发明提供的一种珙桐PCR鉴定方法中，限制性内切酶为AciI。

本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，25μL PCR反应体系为：

本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，PCR的反应条件为：预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，51℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明提供的PCR鉴定珙桐的方法中，20μL酶切反应体系为：PCR产物10μL，10×buffer 2μL，内切酶0.5μL，ddH₂O7.5μL

酶切反应条件为37℃，反应2h。

在本发明的实施例中，PCR反应产物酶切后，用4％琼脂糖凝胶进行电泳。酶切产物大小为279bp，判定为阳性结果，其核苷酸序列见SEQ ID No.4所示。