[发明专利]利用细菌与莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制氢技术，具体地是一种将细菌和莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法。

背景技术

能源危机与环境污染都是当今世界面临的突出问题，氢气是一种清洁、燃烧值高、利用形式多样的可再生生物能源^[1]。光合生物制氢技术能直接转化太阳能为氢能，特别是微藻光合制氢的底物是水，来源丰富，培养容易，不占用可耕地，是利用太阳能生产氢气的理想模式，成为目前国际上生物制氢领域的研究热点^[2]。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因为其氢化酶活性高、培养容易、生长速度快、遗传学背景清晰和转化容易等原因被选为微藻制氢研究的模式物种^[3]。但是，衣藻的氢化酶活性很容易受氧气的抑制而失去活性^[3，4]，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，是导致了衣藻产氢效率低的主要原因。

目前降低莱茵衣藻细胞内氧气含量的方法主要是通过去除培养基中硫元素来抑制光合系统II活性、进而降低光解水产生的氧气^[5]，但是该方法同时抑制了光解水所产生的电子产量，最终仍然导致产氢效率低^[3-5]。因此，要提高莱茵衣藻的产氢效率就需要既降低细胞内的氧浓度又要保障电子的供应。

目前最有效的莱茵衣藻产氢技术为两步法培养技术，即第一步为在正常TAP培养基条件下培养莱茵衣藻，以获得最大生物量；然后收集莱茵衣藻在缺硫培养基中进行产氢培养，最大限度获得氢气产量。

莱茵衣藻在大规模培养时很容易污染其它细菌等微生物，在实验室继代培养过程中也很容易污染一些细菌，并且有些细菌能与莱茵衣藻长期共栖，不显著影响莱茵衣藻的生长。本发明对在实验室继代培养过程中与莱茵衣藻藻株cc849(以下简称衣藻)共栖的细菌进行了分离纯化，得到三株分离菌，命名为L2、L3和L4，经16S rRNA系统发生学分析鉴定，分别与嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株776、微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591和假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8的16S rRNA序列的相似性达到99％，100％和99％。

由于豆科植物根瘤中的固氮酶与莱茵衣藻氢化酶具有相似的特性，都对氧气敏感，但是固氮酶在自然环境中具有高效固氮活性，是因为根瘤中有根瘤菌的缘故。因此本发明还选取了慢生大豆根瘤菌与莱茵衣藻共培养，验证其对莱茵衣藻生长和产氢的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用细菌和莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法，使之更适合于莱茵衣藻及其它微藻两步法产氢技术中的第二阶段增加氧气消耗和提高产氢量的方法。

本发明将上述三株分离菌和一株慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(以下简称根瘤菌)分别与纯净的莱茵衣藻藻株cc849在两步法产氢技术的第一阶段和第二阶段按一定体积比混合进行共培养，结果表明：在第一阶段的营养生长时期，假单胞菌对衣藻的生长有抑制作用，其它三种细菌无显著影响。在第二阶段的产氢培养时期，上述四种细菌都能显著提高衣藻的产氢量，其最大产氢量分别是纯净莱茵衣藻cc849产氢量的4.0倍、2.9倍、4.1倍和5.5倍。对藻菌共培养体系内氧气含量的检测表明呼吸耗氧的增加是细菌-衣藻共培养体系产氢量提高的主要原因。本发明的方法为衣藻两步法产氢技术中进一步提高产氢量提供新方法，随着生物制氢技术的发展，本发明将显现出越来越大的实用性和重要性。

本发明方法的要点是：

本发明提供了一种在莱茵衣藻两步法制氢技术中的第二阶段，向衣藻培养体系中加入一定量的某种细菌以增加培养体系内呼吸耗氧和提高产氢量的方法及具体实施办法。

本发明所使用的某种细菌是这样选取的：在与莱茵衣藻藻株cc849共栖的细菌中分离并纯化出了三株细菌L2、L3和L4，经16S rRNA序列进行系统进化学分析，分别鉴定为嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株776、微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591和假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8。它们都是能与莱茵衣藻共栖的好氧细菌。慢生大豆根瘤菌的选择是由于豆科植物根瘤中的固氮酶与莱茵衣藻氢化酶具有相似的特性，都对氧气敏感，但是固氮酶在自然环境中具有高效固氮活性，是因为根瘤中有根瘤菌的缘故。