[发明专利]青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的蛋白，具体涉及一种青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法。

背景技术

植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深入，发现很多中草药的有效成分均为植物的次生代谢产物，如青蒿中的青蒿素，紫草中的紫草素等，具有重要的药用价值。

天然植株中次生代谢产物含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高。因此，人们开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，植物代谢工程和代谢调控是提高植物次生代谢产物含量的最有效方法之一。植物代谢途径大多是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，对单个基因进行修饰有时难以奏效。而转录调控因子可调控多个参与代谢途径基因的表达，其在植物发育、适应、进化中的作用研究已取得了不少进展。转录因子通常指由核基因编码的一类蛋白质，它们主要以同源或异源二聚体的形式同顺式作用因子发生特异性的结合，通过和某些辅助调控子发生作用而影响转录复合体的形成，从而调节植物基因的特异性表达。改变转录因子的表达往往可导致植物中该转录因子所控制性状的较大改变，因此，利用基因工程的方法调控转录因子是颇具应用价值的植物遗传操作手段。

荷兰Memelink实验室在长春花中所做的研究取得重要进展，他们所发现的ORCA2和ORCA3转录因子是目前所知在植物次生代谢调控中具有重要作用的转录因子，且都属于AP2/ERF家族，是植物特有的一类转录因子。该家族转录因子参与植物多种基因的表达，能调节植物对病原、低温、干旱及高盐等分子的应答反应，提高植物对逆境胁迫的耐受作用。ORCA3应答于MeJA的诱导，可以增强TIAs生物合成代谢途径上多个基因，包括dxs、as、tdc、str、d4h的表达。ORCA3不影响催化开联番木鳖甙生物合成第一步的酶--香叶醇单加氧酶(G10H)，尽管G10H也受甲基茉莉酸调控。在仅过表达ORCA3的转基因细胞系中生物碱含量并没有增加。如果在细胞培养介质中加入一定量的开联番木鳖甙的前体马钱苷后，转ORCA3基因的细胞系生物碱合成比非转基因对照细胞系高3倍。如果通过RACE等技术在青蒿中克隆并得到类似长春花中的ORCA2和ORCA3转录因子，那么就可以利用其对次生代谢的重要调控作用，使用代谢工程手段提高青蒿植株中重要次生代谢产物青蒿素的含量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法。该基因编码一个乙烯相应的AP2-ERF类转录因子(AaORA)，它参与调控青蒿素的合成代谢途径；利用转基因技术将青蒿AaORA转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿中青蒿素的含量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种青蒿AaORA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

第二方面，本发明还涉及编码青蒿AaORA蛋白的核酸序列。

优选地，所述核酸序列的碱基序列为：

如(a)SEQ ID NO：5中第1～1101位所示，

或者是(b)SEQ ID NO：5序列中第1～1101位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。

第三方面，本发明还涉及一种植物干扰表达载体，包含第二方面所述的核酸序列。

第四方面，本发明还涉及一种根癌农杆菌菌株，包含第三方面所述的植物干扰表达载体。

第五方面，本发明还涉及一种转基因青蒿植株的获得方法，包括如下步骤：

(a)克隆第二方面所述的核酸序列；

(b)把所述核酸序列可操作性地连接于表达调控序列，得到植物干扰表达载体；

(c)将植物干扰表达载体转化根癌农杆菌EH105；

(d)利用构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿植株，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株，即转基因青蒿植株。

所述的经PCR检测为阳性的植株是指，分别设计合成AaORA基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。

本发明具有如下的有益效果：